[發明專利]從臍帶中分離和擴增間充質干細胞的方法

無效

• 申請號: 201210160405.2
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN102660503A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 周丹;林卓衡;朱業峰;陳俊峯
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.從臍帶新鮮組織中分離和擴增間充質干細胞的方法，該方法包括以下步驟：

(1)消毒和清洗：用酒精將臍帶組織表面消毒；將臍帶從中間剪開，平鋪在平皿上；利用PBS清洗組織，以減少組織上的紅細胞；

(2)臍帶組織貼壁處理：將組織剪成塊狀，再平鋪于另一細胞培養平皿中，每個平皿中的組織塊數量維持在5-20塊(例如10-15塊)；使組織塊風干2-50分鐘直至組織貼在平皿上；

(3)臍帶組織培養：沿平皿邊緣慢慢加入間充質干細胞專用培養基至組織淹沒即可；將平皿放進CO₂濃度為5%的37℃培養箱進行培養，培養至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)時將平皿從培養箱取出，補加適量(使組織淹沒即可)間充質干細胞專用培養基；在第9-11天(例如第10天)時將平皿中的培養基移出，加入適量(使組織淹沒即可)新鮮的間充質干細胞專用培養基，繼續培養；在第11-13天(例如第12天)時清除所有臍帶組織塊并繼續培養；此后每1-3天(例如每2天)進行一次全換液；

(4)細胞傳代：當平皿內的貼壁細胞融合率達到50-70%左右時，使用消化酶(例如TrypLE?Express，invitrogen產品)使貼壁細胞脫離平皿底部；離心，去除上清液，加入間充質干細胞專用培養基重新懸浮細胞，再接種于T25細胞培養瓶進行傳代并進行擴增培養；此后每1-3天(例如每2天)換液一次，直至融合率達到70-90%后，即得臍帶間充質干細胞，必要時進行傳代；

以及任選的下列一個或多個步驟：

(5)針對步驟(4)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項：細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；

(6)將步驟(4)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中凍存，備用。

2.根據權利要求1的方法，其中所述臍帶是臍帶的新鮮組織。

3.根據權利要求1的方法，其中步驟(2)中，剪碎的組織是大小約0.2-2.5立方厘米。

4.根據權利要求1的方法，其中步驟(2)中，組織塊風干的時間為2-50分鐘。

5.根據權利要求1的方法，其中所述間充質干細胞專用培養基中包含FBS、L-Glutamine、Gentamicin和DMEM-F12。

6.根據權利要求1的方法，其中：

所述間充質干細胞專用培養基中含有10-20%的FBS；

所述間充質干細胞專用培養基中含有0.5-2%的L-Glutamine；

所述間充質干細胞專用培養基中含有0.02-0.1%的Gentamicin；和/或

所述間充質干細胞專用培養基中含有80-90%的DMEM-F12。

7.根據權利要求1的方法，其中所述間充質干細胞專用培養基中含有約15重量份的FBS、約1重量份的L-Glutamine、約0.05重量份的Gentamicin和約84重量份的DMEM-F12。