[發明專利]恩拉霉素標準品的高壓液相制備方法

有效

• 申請號: 201210159394.6
• 申請日: 2012-05-22
• 公開（公告）號: CN102675427A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 崔厚華;冷董碧;殷曉浦;黃苓;劉雅晶
• 申請（專利權）人: 江西興鼎科技有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/16;G01N33/68
• 代理公司: 江西省專利事務所 36100
• 代理人: 黃新平

技術領域

本發明涉及一種恩拉霉素標準品的高壓液相制備方法。

背景技術

恩拉霉素(enramycin)是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的多肽類抗生素，其中氨基酸分子構成環狀多肽結構，脂肪酸位于多肽結構末端。據其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉A(C₁₀₇H₁₃₈C_l2N₂₆O₃₁)和恩拉霉素B(C₁₀₈H₁₄₀C_l2N₂₆O₃₁)，恩拉霉素則是由這兩種成分組成的混合物。恩拉霉素的鹽酸鹽為白色結晶性粉末，分子量約為2500，熔點為?238～245℃，易溶于二甲亞砜，可溶于甲醇、含水乙醇，難溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素的鹽酸鹽對熱、光照和潮濕有極好的穩定性。恩拉霉素在飼料中具有很高的穩定性，在室溫條件下長期儲藏很少降解，在制成顆粒料過程中也非常穩定，與飼料混合后在室溫下長期儲藏效價下降甚微。恩拉霉素在腸道內不被降解，能夠保持原有的抗菌活性。目前尚未發現涉及恩拉霉素標準品制備方法的報導。

發明內容

本發明的目的就是提供一種簡單快捷，易于操作，制備的標準品純度高的恩拉霉素標準品的高壓液相制備方法。

本發明的恩拉霉素標準品的高壓液相制備方法，包括以下步驟：

1、發酵菌體試樣溶液制備：

將發酵菌體用去離子水清洗后，按30-90ml/g的比例懸浮在由丙酮：鹽酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮為分析純濃度，鹽酸溶液的濃度為2mol/L，用超聲破碎儀或者超聲機進行細胞破碎10min，得到的混合物在20℃，180rpm的條件下振蕩提取90?min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的轉速下離心10min，收集上清液，用0.45μm濾膜過濾作為試樣溶液備用，試樣溶液濃度不超過2000μg/ml；

動物飼料試樣溶液制備：?

按GB/T?14699.1的規定選取動物飼料樣品200g-500g，用四分法縮至100g，粉碎通過0.45mm孔徑篩，混勻，貯存于磨口瓶中備用，取上述動物飼料樣品5-10g，加入到80ml的由丙酮：鹽酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮為分析純濃度，鹽酸溶液的濃度為2mol/L，在20℃，180rpm的條件下振蕩提取90min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的轉速下離心10min，收集上清液，用0.45μm濾膜過濾作為試樣溶液備用，試樣溶液濃度不超過2000μg/ml。

2、恩拉霉素標準品制備：按下列條件進行反相高壓液相色譜：?

試樣溶液濃度：不超過2000μg/ml；?

進樣量：100μl；

色譜柱：?C18柱半制備型，長250mm，內徑10mm，粒度5μm；

流動相：B：色譜純乙腈,?A：0.2%乙酸，制法是，吸取2ml色譜純乙酸，溶于1000ml純凈水中；?

流速：2.0ml/min；?

柱溫：30℃；?

檢測波長：267nm；?

根據組分A和組分B的保留時間進行收集；

將收集的組分A峰和組分B峰分別按常規的旋轉蒸發工藝除去溶劑，即得恩拉霉素組分標準品。

所述的發酵菌體是指發酵液中恩拉霉素產生菌的菌絲體。?

所述的動物飼料是指動物配合飼料、濃縮飼料、預混合飼料或恩拉霉素預混劑。

本發明的恩拉霉素標準品的高壓液相制備方法，具有以下優點：1：前處理簡單快捷，易于操作；2、收集方法簡單，只要根據保留時間收集相應組分即可；3、制備的標準品純度高，純度能達到90%以上；4、能將組分A和組分B分開收集，為日后理論研究奠定基礎。

具體實施方式

實施例1：將發酵菌體用去離子水清洗后，按65ml/g的比例懸浮在由丙酮：鹽酸溶液：水=20：1：21比例混合的提取液中，丙酮為分析純濃度，鹽酸溶液的濃度為2mol/L，用超聲破碎儀或者超聲機進行細胞破碎10min，得到的混合物在20℃，180rpm的條件下振蕩提取90?min，得到含有恩拉霉素的提取液，然后在10000r/min的轉速下離心10min，收集上清液，用0.45μm濾膜過濾作為試樣溶液備用。

將處理好的樣品按下面的色譜條件進樣：

進樣量：100μl；?