[發明專利]單純皰疹病毒Ⅱ型基因重組減毒活疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201210159325.5
• 申請日: 2010-08-16
• 公開（公告）號: CN102671193A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 劉景偉
• 申請（專利權）人: 鄭州金森生物科技工程有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;C12N7/04;C12N15/38;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州紅元帥專利代理事務所(普通合伙) 41117
• 代理人: 黃軍委

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種能夠防治單純皰疹病毒II型感染所致疾病的基因重組減毒活疫苗及其制備方法。?

背景技術

單純皰疹病毒(herpes?simplex?virus，HSV)是一種經皮膚和粘膜密切接觸傳播的病毒，包括單純皰疹病毒I型(簡稱HSV-1)和單純皰疹病毒II型(簡稱HSV-2)，兩種病毒具有83％以上的共同基因特征，50％以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可高達80％以上，并長期潛伏于感覺神經節內，雖然大多數HSV-1感染者沒有明顯癥狀，但少數感染者可產生終生的反復發作的面口皰疹、致盲性很高的眼內眼炎以及致命性的皰疹性肺炎和皰疹腦炎。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，占生殖器皰疹原發感染的90％以上。II單純皰疹病毒感染人類后主要引起生殖系統原發性和復發性皰疹，可以終生潛伏在神經節內，在機體免疫力降低時復發。孕婦感染HSV-II型病毒后易發生流產，也可致胎兒先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導致高熱、呼吸困難或中樞神經系統病變，其中60％-70％的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰疹可將艾滋病感染風險增加2-3倍，并促進艾滋病病毒的傳播。研究表明安全套并不能有效預防皰疹病毒感染，世界范圍內生殖器皰疹發病率在逐年上升，據美國最新統計數據顯示，美國成人生殖器皰疹患病率已經上升到了16％以上，在紐約已經上升至25％以上，目前并無單純皰疹病毒感染，尤其是復發性感染的特效治療方法，抗病毒藥物常規用藥雖能緩解一些臨床癥狀，但不能徹底清除體內潛伏的病毒，也不能減少復發次數，因此迫切需要開發能有效防治單純皰疹病毒感染的疫苗。?

近數十年來世界各國HSV疫苗的研究結果表明，傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗免疫原性弱，僅能誘導體液免疫應答，細胞免疫誘導效果較差；新型DNA疫苗雖能同時誘導體液和細胞免疫，但是其轉染效率較低，經粘膜免疫誘導有效的粘膜免疫應答能力更低。而在單純皰疹病毒的免疫應答過程中，細胞免疫和粘?膜免疫發揮著更大的作用，但上述幾類疫苗均不能有效誘導細胞免疫和粘膜免疫應答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應用的疫苗上市，單純皰疹病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研究階段。?

病毒減毒活疫苗是最為經典的疫苗形式，這種類型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰質炎疫苗等在人類抵抗感染性疾病的歷史上發揮了不可替代的作用，為人類的健康做出了不可磨滅的貢獻。減毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一樣的感染和復制特性，但沒有致病作用，此類疫苗可以有效地誘導機體產生全面的免疫應答，相對于其它種類的疫苗而言，免疫原性強，保護效果好。?

傳統的減毒活疫苗主要是通過連續培養篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。近年來，研究者開始采用現代分子生物學技術，將HSV基因組的特定基因進行敲除以獲得重組株。本發明則是利用現代分子生物學技術，以Genebank中的HSV-1和HSV-2基因組參考序列(HSV-1登錄號：NC_001806，HSV-2登錄號：NC_001798)為藍本，通過聯合敲除多個基因，篩選出了HSV-1型和HSV-2型重組減毒株，它們的致病能力均發生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-1和HSV-2感染所致疾病。?

發明內容

本發明的目的是提供能夠預防和治療單純皰疹病毒II感染所致疾病的重組減毒活疫苗及所述疫苗的制備方法。?

本發明涉及的單純皰疹病毒II型重組株，均由野生HSV-2經過重組、篩選和純化得來的。?

所采用的技術方案是取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分離鑒定出野生型HSV-1和HSV-2；擴大培養后提取病毒完整基因組；和含有熒光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的同源側翼序列的穿梭載體共同轉染Vero細胞；在熒光顯微鏡下使用一種或者聯合使用多種熒光蛋白基因作為標記挑選出重組病毒，經過空斑純化后可獲得所需要的重組減毒活疫苗。?

可以獲得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特征是敲除了其基?因組中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因的HSV-2重組株。?

可以獲得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在于聯合敲除了其基因組中的UL43～UL47基因和其它復制或感染非必需基因片段的HSV-2重組株：所述其它復制或感染非必需基因片段是US9～US12基因。?

用類似的方法在上述重組株的基礎上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一步減低的重組株。?