[發(fā)明專利]一種篩查ALK融合基因的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210158412.9
• 申請日: 2012-05-18
• 公開（公告）號: CN102888452A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設計）人: 陳海泉;孫藝華;王瑞;潘云建;胡海川;李晨光;王磊;葉挺;羅曉陽;李航;張揚
• 申請（專利權(quán)）人: 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ALK融合基因的篩查方法，尤其是ALK融合基因篩查的多片段引物及其應用。

背景技術(shù)

據(jù)研究報道，對于非小細胞肺癌(NSCLC)，針對特定的靶點開展個體化治療已成為現(xiàn)實，例如通過檢測表皮生長因子受體(EGFR)基因突變，篩選適合EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療的患者亞群。據(jù)美國麻省總醫(yī)院研究人員發(fā)表研究論文稱，檢測一種間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可對NSCLC患者作進一步細分。

ALK融合基因于2007年開始見諸NSCLC相關(guān)研究報告。在此之前，研究者已經(jīng)在多種腫瘤中識別了涉及ALK的基因變異，例如間變性大細胞淋巴瘤、炎性成肌纖維細胞瘤和成神經(jīng)細胞瘤等，但不包括肺癌。

現(xiàn)有技術(shù)公開了ALK融合基因迄今已發(fā)現(xiàn)多種變異類型。分析這些融合基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其ALK部分均包括開始于第20外顯子的編碼細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的基因片段。經(jīng)檢測，所有這些融合基因均有生物學功能，其表達產(chǎn)物為一種嵌合酪氨酸激酶。

傳統(tǒng)上對ALK融合基因的篩查包括兩種主要形式：1、普通PCR，通過設計引物，對某一種具體的融合形式進行擴增，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果；2、熒光原位雜交(FISH)，通過熒光標記的DNA探針特異性地與腫瘤組織DNA中ALK基因5’端和3’端進行雜交，結(jié)果在熒光顯微鏡下判讀。

對于普通PCR篩查方法，實踐顯示其具有以下明顯缺陷：由于ALK融合基因的具體形式眾多，所以至少需要設計多對PCR引物，分別進行多次PCR反應，費時費力；并且如果樣本是一種新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，則使用此方法則無法有效地進行檢測，而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

對于熒光原位雜交(FISH)，雖然目前被認為是診斷融合基因的金標準，但是其價格高昂，實驗步驟復雜，對操作人員的技術(shù)水平要求極高，致使其亦無法進行推廣。因此，目前臨床實踐中需要提出更加簡單、方便、靈敏的ALK融合基因的篩查工具和篩查方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷與不足，提供一種新的篩查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time?PCR聯(lián)合引物及其應用。

本發(fā)明提供了篩選ALK融合基因的real-time?PCR聯(lián)合引物。

本發(fā)明的進一步目的是提供上述real-time?PCR聯(lián)合引物在篩查ALK融合基因方法中的應用，本發(fā)明方法能準確、簡捷、經(jīng)濟、直觀地判斷ALK融合基因存在與否。

本發(fā)明的篩查ALK融合基因方法，以樣本中的總RNA反轉(zhuǎn)的cDNA為模板，加入real-time?PCR聯(lián)合引物，進行實時熒光聚合酶鏈反應，并通過檢測反應產(chǎn)物中反應單位間Ct值的差值檢驗是否具有ALK融合基因。本方法具有操作簡捷，節(jié)約時間，結(jié)果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點。

具體而言，本發(fā)明提供的一種篩選ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步驟：

(1)設計篩查ALK融合基因的7對real-time?PCR聯(lián)合引物或探針；

(2)提取樣本中的總RNA；

(3)以樣本中的總RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA；

(4)在7個real-timePCR反應單位中，以(3)中所得的cDNA為模板，分別加入(1)中設計的7對引物或探針，以及包括熒光染料在內(nèi)的反應預混液；

(5)在real-time?PCR反應儀上進行real-time?PCR反應，并分別記錄每個樣本的7個反應單位的熒光閾值(Ct值)；

(6)分別計算引物或探針I(yè)～IV所在反應體系的Ct值的均值Ct_ABP，和引物或探針V～VII所在反應體系的CT值的均值Ct_BBP；

(7)計算相對表達量值2^-ΔCT，其中-ΔCT＝-(Ct_ABP-Ct_BBP)；如2^-ΔCT大于12，則認為該樣本具有ALK融合基因。