[發明專利]一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210157894.6
• 申請日: 2012-05-21
• 公開（公告）號: CN102676490A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張輝;王冉;包紅朵
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A23B4/22;A23B5/16;A23B9/28;A23B7/155;A23C9/12;A23L3/3571;A61K38/51;A6
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 程化銘

技術領域

本發明涉及屬于生物工程領域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶（或稱裂解酶）及其作為抗菌物質在預防奶牛乳房炎和食品污染控制中的應用。

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背景技術

奶牛乳房炎不僅給世界乳品工業帶來巨大的經濟損失，而且還危害到公共衛生和人類健康。研究資料顯示，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，由此引起的奶牛乳房炎病例達74％，在我國病例中該比例高達90％-95％，由此引起的奶產品的損失高達3.5億。

引起奶牛乳房炎的主要原因是病原微生物感染，其中以金黃色葡萄球菌（Staphyloccus?aureus）、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占奶牛乳房炎病例的90％以上。其中SA則是引起乳房炎的最主要病原菌，也是臨床上最難治療造成經濟損失最大的致病菌，可致人或動物的各種化膿性疾病、乳腺炎、敗血癥等。奶牛乳房炎最直接的治療途徑是使用抗生素，但治療過程中乳汁會殘留抗生素，從而會對人體產生一定的危害，更為嚴重的是，病原會因抗生素的長期攝入及高效量的濫用產生耐藥毒力株。隨著抗生素的廣泛應用，金黃色葡萄球菌對抗生素不僅產生耐藥，且表現為多重耐藥，給臨床治療帶來了巨大困難。

噬菌體是一類細菌依賴性的病毒，又稱細菌病毒。裂解性噬菌體感染細菌后，可在宿主菌內快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。溶壁酶是雙鏈DNA噬菌體所特有的，是在感染宿主晚期由噬菌體表達的一類肽糖水解酶，該酶通過水解細菌細胞壁肽糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內氨基酸殘基間的連鍵最終使宿主細胞裂解。溶壁酶不僅特異性作用于宿主，且作用時間短，作用譜較噬菌體廣。溶壁酶具有高效、特異且不產生抗性等特點，目前在食品及醫藥行業已有成功應用的報道。金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶能夠特異性裂解李斯特菌，因而具有殺菌作用。在食品中，金黃色葡萄球菌溶壁酶能夠作為抗菌劑來控制細菌污染，具有潛在的開發和應用價值。

發明內容

發明目的

本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶。

技術方案

一種金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶，其特征在于其氨基酸序列為Seq?ID?NO.2。

一種金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶的編碼基因，其特征在于其核苷酸序列為Seq?ID?NO.1。

一種表達金黃色葡萄菌噬菌體溶壁酶的制備方法，其特征在于步驟1）中采用引物5’-?ATT?GGA?TCC?GGT?AGG?TGT?TGA?CCA?ATG?TTG?-3’見Seq?ID?NO.3和引物5’-?CTT?AAG?CTTTAA?ATC?GTG?CTA?AAC?TTA?CC?-3’?見Seq?ID?NO.4從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組中擴增李斯特菌噬菌體溶壁酶基因；

具體步驟如下

1)????????從金黃色葡萄球菌噬菌體基因組中擴增金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶基因；

2)????????構建表達金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的重組表達載體；

3)????????將重組表達載體轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選得到表達金黃色葡萄球噬菌體溶壁酶的工程菌；

4)????????異丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷誘導表達，獲得重組基因表達產物；

5)????????將重組基因表達產物，經鎳柱親和層析純化分離，得到重組的金黃色葡萄球噬菌體溶壁酶；

6)????????將純化的溶壁酶產物經去毒素試劑盒進行去毒處理即≤0.01?EU/μg內毒素。?

一種含有所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶的編碼基因的質粒。

一種含有所述的質粒的重組菌

所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備防治奶牛乳房炎藥物的應用。

所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球菌污染或過度生長藥物應用。

所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長藥物應用，其特征在于所述的食品為由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。

所述的一種金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶在制備抑制金黃色葡萄球污染或過度生長藥物應用，其特征在于重組表達的金黃色葡萄球菌噬菌體溶壁酶產物制成抗菌劑。