[發明專利]一種微載體懸浮培養細胞接種禽流感病毒的方法

有效

• 申請號: 201210153623.3
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102676460A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 陳瑞愛;徐家華;施維松;張冬霞;湯欽
• 申請（專利權）人: 肇慶大華農生物藥品有限公司;廣東大華農動物保健品股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C12N5/02;C12N5/071
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

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技術領域

本發明涉及禽流感疫苗技術領域，具體地，涉及一種微載體懸浮培養細胞接種禽流感病毒的方法。

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背景技術

過去我國一直通過雞胚培養生產流感疫苗。由于雞胚生產流感疫苗需要消耗大量雞胚，生產周期長，易污染，不易于控制，而且每只受精雞蛋一次只能注射一個病毒菌株，因此這種生產方法效率很低，不利于應對大規模的流感爆發。我國禽流感在不同地區流行情況不同，并且禽流感在不同地區之間的擴散快；用雞胚生產禽流感疫苗，生產多少疫苗必須提前做出精確計劃，但一般來說禽流感爆發，人們很難在短時間內購置生產疫苗所需的數百萬只雞蛋。為此，世界衛生組織、美國政府等都鼓勵發展細胞培養技術替代目前的雞胚培養技術來生產流感疫苗。

以哺乳動物細胞為基質制備疫苗具有無外源因子污染、?易于規模化生產、?能較好的維持病毒抗原穩定等優點。但是,僅僅依靠動物細胞培養生產病毒的量有限,因此將載體培養技術應用于禽流感疫苗的生產,?無疑將既保持細胞培養的優勢又克服了其生產產量有限的缺點。目前常使用的有兩種載體，一種是片狀載體，另外一種是球狀載體。由于多數禽流感病毒入侵細胞過程中需要使用少量胰酶。而血清中含有胰酶抑制物，因此在接種和繁殖禽流感病毒過程中不能添加血清。而載體培養細胞過程中需要添加血清。如果使用片狀載體培養細胞，其片狀載體是固定在生物反應器中，在接種和繁殖禽流感病毒時，去除培養基中的血清就非常容易，只需要使用PBS或者不含血清的培養基清洗就行了。而使用微載體培養細胞時，在接種和繁殖禽流感病毒就出現下面情況：1）由于球形微載體小（100微米左右），質量輕，在更換培養基或者使用PBS清洗的過程中微載體隨著溶液丟失的現象比較嚴重；2）細胞在微載體上長滿后，由于細胞與細胞之間的相互作用，多個微載體很容易連接在一起；3）在病毒接種過程中，由于為了使病毒接種液與載體均勻混合，但生物反應器攪拌的速度又不能過快，否則影響病毒入侵細胞。這樣經常容易造成部分微載體沉淀在生物反應器底部，而引起接毒不均勻甚至根本沒有接上病毒的現象。但是微載體培養細胞繁殖禽流感病毒具有下列優勢：1）容易擴大；2）容易收集細胞。?

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發明內容

為了解決微載體培養細胞繁殖禽流感病毒過程中出現的一系列問題，本發明提供了一種微載體懸浮培養細胞接種禽流感病毒的方法。該方法解決微載體培養細胞繁殖禽流感病毒過程出現的載體丟失、血清清洗不干凈、接毒不均勻甚至接不上禽流感病毒等問題。

本發明的技術方案如下：微載體懸浮培養細胞接種禽流感病毒的方法，包括如下具體步驟

1：選擇導入載體所需要的種細胞MDCK或者Vero；

2：轉瓶繁殖細胞傳代的方法：首先復蘇步驟1所選擇的種細胞到T225的細胞瓶中，生長48h左右，按照1：4的比例進行傳代；然后把4個長滿細胞的T225細胞瓶中的細胞傳到1個15L轉瓶進行培養；48小時左右按照1：4或1：3的比例進行細胞傳代培養；

3：收獲轉瓶中的細胞：將步驟2所得細胞用PBS洗滌2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L轉瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液，其它類型的轉瓶按照類似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集細胞；

4：收獲的細胞計數后，按照每個微載體添加5-20個細胞的比例進行細胞接種；每升培養基中加入2-10克微載體；

5：生物反應器培養接種細胞：

生物反應器投放載體的量為2-10克/升；生物反應器培養細胞的培養基為MEM（Hyclone）；血清使用濃度為7-10%；CO₂通氣量為5-10%；溶氧量為40-60%的溶液飽和溶氧量；溫度為37℃；攪拌速度為30-55轉/分，pH為6.8-7.4；90-95%以上的微載體在細胞接種后48-72h期間能夠達到接種禽流感病毒的要求；

6：步驟5培養的細胞達到接種禽流感病毒的要求后，進行下述步驟：在攪拌的狀態下，通過虹吸的原理，把生物反應器中的培養基連帶微載體一起轉移到放置有150-250目不銹鋼篩網的容器中，該容器頂部含有三通孔，能夠控溫37℃，容器下部裝有與容器緊密固定在一起的不銹鋼篩網，該容器的底部含有一個排液出口；容器中的培養基通過排液出口排掉；然后用PBS洗滌收集在容器中的微載體，并通過容器的底部排液出口排出PBS；