[發(fā)明專利]一種微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210153623.3 | 申請日： | 2012-06-19 |
| 公開（公告）號： | CN102676460A | 公開（公告）日： | 2012-09-19 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳瑞愛;徐家華;施維松;張冬霞;湯欽 | 申請（專利權(quán)）人： | 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N7/00 | 分類號： | C12N7/00;C12N7/02;C12N5/02;C12N5/071 |
| 代理公司： | 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288 | 代理人： | 湯喜友 |
| 地址： | 526000 廣東省*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 載體 懸浮 培養(yǎng) 細胞 接種 禽流感 病毒 方法 | ||
1.微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，包括如下具體步驟
1：選擇導入載體所需要的種細胞MDCK或者Vero；
2：轉(zhuǎn)瓶繁殖細胞傳代的方法：首先復蘇步驟1所選擇的種細胞到T225的細胞瓶中，生長48h左右，按照1：4的比例進行傳代；然后把4個長滿細胞的T225細胞瓶中的細胞傳到1個15L轉(zhuǎn)瓶進行培養(yǎng)；48小時左右按照1：4或1：3的比例進行細胞傳代培養(yǎng)；
3：收獲轉(zhuǎn)瓶中的細胞：將步驟2所得細胞用PBS洗滌2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L轉(zhuǎn)瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液，其它類型的轉(zhuǎn)瓶按照類似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集細胞；
4：收獲的細胞計數(shù)后，按照每個微載體添加5-20個細胞的比例進行細胞接種；每升培養(yǎng)基中加入2-10克微載體；
5：生物反應器培養(yǎng)接種細胞：
生物反應器投放載體的量為2-10克/升；生物反應器培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基為MEM（Hyclone）；血清使用濃度為7-10%；CO2通氣量為5-10%；溶氧量為40-60%的溶液飽和溶氧量；溫度為37℃；攪拌速度為30-55轉(zhuǎn)/分，pH為6.8-7.4；90-95%以上的微載體在細胞接種后48-72h期間能夠達到接種禽流感病毒的要求；
6：步驟5培養(yǎng)的細胞達到接種禽流感病毒的要求后，進行下述步驟：在攪拌的狀態(tài)下，通過虹吸的原理，把生物反應器中的培養(yǎng)基連帶微載體一起轉(zhuǎn)移到放置有150-250目不銹鋼篩網(wǎng)的容器中，該容器頂部含有三通孔，能夠控溫37℃，容器下部裝有與容器緊密固定在一起的不銹鋼篩網(wǎng)，該容器的底部含有一個排液出口；容器中的培養(yǎng)基通過排液出口排掉；然后用PBS洗滌收集在容器中的微載體，并通過容器的底部排液出口排出PBS；
7：然后關(guān)閉排液出口，把禽流感病毒-胰酶接種液加入到步驟6所得收集有微載體的容器中，同時連通容器的底部閥門和頂部三通管的一個孔，并且使用蠕動泵緩慢的泵禽流感病毒-胰酶接種液使其在長滿細胞的微載體上慢慢的循環(huán)流動，以便病毒均勻接種；
8：細胞接種病毒后，向步驟7所得裝有微載體的容器加入不含血清的MEM培養(yǎng)基，并利用虹吸的原理通過虹吸使微載體連同培養(yǎng)基一起加入到生物反應器中，然后進行病毒繁殖，病毒在生物反應器中繁殖的條件為：培養(yǎng)基為MEM（Hyclone）；?CO2通氣量為5-10%；溶氧量為40-60%的溶液飽和溶氧量；溫度為37℃；
攪拌速度為30-45轉(zhuǎn)/分，pH為6.5-7.2;
9：收集禽流感病毒液。
2.如權(quán)利要求1所述的微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，步驟6中，通過150-250目不銹鋼篩網(wǎng)收集已經(jīng)長滿細胞的微載體。
3.如權(quán)利要求1所述的微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，步驟6中，用PBS洗滌收集在容器中的微載體重復2-3次。
4.如權(quán)利要求1所述的微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，步驟7中，禽流感病毒接種過程中，微載體和細胞在不流動的情況下，通過蠕動泵緩慢的泵禽流感病毒-胰酶接種液使其在長滿細胞的微載體上慢慢的循環(huán)流動，以便病毒均勻接種。
5.?如權(quán)利要求1所述的微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，步驟7中，病毒繁殖過程中，當病毒繁殖培養(yǎng)基pH低于6.5或者禽流感病毒HA價高于9.0，就更換部分溶液。
6.?如權(quán)利要求1所述的微載體懸浮培養(yǎng)細胞接種禽流感病毒的方法，其特征在于，所述微載體為Cytodex?I或hyclone。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，未經(jīng)肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201210153623.3/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
