[發明專利]一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立及應用

無效

• 申請號: 201210153576.2
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102732548A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;黃昆侖;馬骉;王云鵬;宋夢薇;張雅楠
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;北京賽升藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N9/64
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高效表達人源蛇毒激肽原酶的麥胚無細胞蛋白合成系統、其構建方法及應用。?

背景技術

激肽原酶是動物體內的一種蛋白水解酶，存在于許多器官的組織中。人們認識最早、研究最為清楚的是蛇毒中的胰激肽原酶。胰激肽原酶（Pancreatic?Kallidinogenase）又稱為胰激肽釋放酶（Pancreatic?Kallikrein）是一類內切型蛋白水解酶，存在于哺乳動物體內的多種組織，尤以蛇毒中含量最為豐富。在體內作用于激肽原，使其釋放出激肽，從而發揮出一系列的藥理作用：使微血管擴張，改善外周血液循環；促進前列腺素分泌，擴張小動脈，增加腎血管流量；激活纖溶酶系統，使纖維蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。臨床上主要用于微循環障礙引起的腎病變及眼底供血障礙、高血壓癥、腦動脈硬化和腦動脈血栓、冠心病及其它閉塞性周圍血管性疾病的治療。?

目前國內臨床上所使用的激肽原酶均為從哺乳動物的胰腺中提取，純度不高，具有一定的抗原性，進入人體后，可能誘發一系列的抗原抗體反應，已有報道注射胰激肽原酶導致固定性藥疹及重癥多形紅斑藥疹，且不能實現靜脈注射給藥，使藥物不能最大限度發揮作用。經過多年的臨床實踐，發現江浙蝮蛇蛇毒類激肽原酶有最好的療效。然而蛇毒資源是非常有限的，如果通過基因工程來獲得產品，則是一個很有前途的途徑。?

為此，本發明利用基因工程技術，通過反轉錄克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，利用麥胚無細胞蛋白合成系統對其進行表達，使蛇毒激肽原酶的安全生產成為可能，同時為蛇毒激肽原酶的結構和性質研究提供了實驗材料。?

發明內容

本發明的目的是提供一個能夠高效表達重組蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統。?

本發明的另一目的是提供上述高效麥胚無細胞蛋白合成系統的構建方法。?

本發明的進一步目的是提供上述高效麥胚無細胞蛋白合成系統在生產重組蛇毒激肽原酶中的應用。?

為了實現本發明目的，本發明的一種含有蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其出發菌株為大腸桿菌DH5α。?

上述基因工程菌的構建方法，其包括步驟：1）從江浙蝮蛇組織中提取總RNA，經RT-PCR擴增得到VK基因；2）將步驟1）中得到的VK基因插入到表達載體中；3）將步驟2）中構建的表達載體轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到重組大腸桿菌工程菌。?

前述的方法，其中所述表達載體的出發載體為pCS²⁺。?

前述的方法，其中所述VK基因具有Seq?ID?No:1所示的核苷酸序列。?

為了獲得麥胚無細胞表達載體質粒，本發明通過反轉錄江浙蝮蛇組織得到VK基因，用PCR方法在5’端加上GGATCC以構成BamHI酶切位點，在BamHI后加入CACCATCATCATCATCAT以構成組氨酸標簽，3’端加上CTCGAG以構成XhoI酶切位點，然后經BamHI及XhoI兩種酶消化后，即可直接克隆至pCS²⁺質粒，得到pCS²⁺/VK質粒。?

本發明以pCS²⁺作為表達載體，是由于pCS²⁺適合于麥胚無細胞表達系統。目的基因被克隆到pCS²⁺質粒載體上，受SP6轉錄及翻譯（可?選擇）信號控制；由外源SP6?RNA聚合酶誘導進行轉錄。該系統適合眾多實驗應用，如：細菌或哺乳動物蛋白的細胞內表達，無細胞表達等。此外在pCS²⁺質粒載體上所表達的外源蛋白的N端引入His蛋白標簽，可以用Ni柱洗脫的方法進行純化，從而極大地簡化了重組蛋白的后續純化工作，非常適合目的蛋白的收集。?

本發明以輪選987硬質小麥為原料，先人工將麥胚分離出來，液氮中磨碎加入抽提物緩沖液，離心取上清得到麥胚抽提物，-80℃保存備用。抽提物緩沖液包括：40mM?Hepes–KOH?pH7.6、100mM醋酸鉀、5mM醋酸鎂、2mM氯化鈣和4mM?DTT。?

將上述pCS2+/VK麥胚無細胞表達載體與SP6?RNA聚合酶、NTP以及相應緩沖液混合后37℃反應4h，得到重組蛇毒激肽原酶mRNA。將所得mRNA與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合后，用雙層法，反應16h得到目的蛋白。翻譯緩沖液包括：25mM?Hepes-KOH?pH7.6、100mM醋酸鉀、2.7mM醋酸鎂、1.0mM?ATP、0.25mM?GTP、16mM磷酸肌酸、0.4mM各種氨基酸、0.4mM亞精胺、5mM?DTT。?