[發明專利]一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立及應用

無效

• 申請號: 201210153576.2
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102732548A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 羅云波;許文濤;黃昆侖;馬骉;王云鵬;宋夢薇;張雅楠
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;北京賽升藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，其包括步驟：1）從江浙蝮蛇組織中提取總RNA，經RT-PCR擴增得到蛇毒激肽原酶VK基因；2）以pCS²⁺作為表達載體，將VK基因插入到表達載體中并引入His標簽得到麥胚無細胞表達載體質粒；3）將表達載體轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到重組大腸桿菌工程菌，建立體外轉錄、翻譯系統。

2.如權利要求1所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，該系統含有蛇毒激肽原酶（VK）基因的表達載體，所述蛇毒激肽原酶基因具有Seq?ID?No:1所示的核苷酸序列。

3.如權利要求1或2所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，建立體外轉錄系統，提取權利要求4所述工程菌中質粒進行表達包括：建立體外轉錄體系，將提取質粒加入體系中于37℃反應4h，得到的轉錄產物，所述體外轉錄體系包括：5mM?ATP、5mM?CTP、5mM?GTP、5mM?UTP、80mMHepes–KOH?pH7.6,16mM醋酸鎂、2mM亞精胺、10mM?DTT、15單位SP6RNA聚合酶。

4.如權利要求1或2所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，建立體外翻譯系統，將權利要求5中得到的轉錄產物與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合26℃反應16h，得到目的蛋白并進行純化，所述翻譯緩沖液包括：25mMHepesKOH?pH7.6、100mM醋酸鉀、2.7mM醋酸鎂、1.0mM?ATP、0.25mM?GTP、16mM磷酸肌酸、0.4mM各種氨基酸、0.4mM亞精胺、5mM?DTT。

5.如權利要求4所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，所述目的蛋白的純化方法，包括如下步驟：

1）收集含有目的蛋白的反應液；

2）將步驟1）中得到的混合液與His?TrapTM?FF凝膠柱結合，用洗滌緩沖液除去未結合的蛋白，然后用洗脫緩沖液洗脫，得到目的蛋白；所述洗脫緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、40mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值為8.0；所述洗滌緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、100mmol/L咪唑、0.5mol/L?NaCl、8mol/L尿素，pH值為8.0；所述洗脫緩沖液含有20mmol/L磷酸鈉、500mmol/L咪唑、0.5mol/L?NaCl、8mol/L尿素，pH值為8.0。

6.如權利要求6所述的一種表達蛇毒激肽原酶的高效麥胚無細胞蛋白合成系統的建立方法，其特征在于，所述體外翻譯系統的優化為向轉錄產物與麥胚抽提物和翻譯緩沖液混合液補充質粒載體30ng/μl,SP6RNA聚合酶15U,NTP及轉錄緩沖液適量，磷酸肌酸25mM以及Cu²⁺5mM反應16h，可使麥胚無細胞系統表達的VK蛋白產量由0.13mg/ml提高到0.74mg/ml。

7.麥胚無細胞系統表達的VK蛋白的純化方法，包括如下步驟：

1）蛋白翻譯完成后收集翻譯混合液體；

2）用His?TrapTM?FF凝膠柱進行親和層析；

3）通過梯度透析，將蛇毒激肽原酶蛋白脫鹽。

8重組蛇毒激肽原酶活性檢測，其特征在于,測定方法：在253nm波長處，以底物溶液為空白，準確讀取1分鐘的吸光度A1和3分鐘的吸光度A3，ΔA值（ΔA=A3－A1）的平均值代入下式計算：

底物溶液含N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽（BAEE）17.7mg，1MTris-HCl?pH8.0。