[發明專利]大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其特異性LAMP引物組合物和應用

有效

• 申請號: 201210153468.5
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102676511A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王源超;戴婷婷;董莎萌;鄭小波
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其特異性LAMP引物組合物和應用。?

背景技術

大豆疫霉菌（Phytophthora?sojae?Kaufmann&Gerdemann）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產上的毀滅性病害之一，也是我國對外公布的一類檢疫對象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美國印第安那州被發現^[3]，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多個大豆生產國家相繼報道了該病害的發生^[2，6]。蘇彥純^[10]等于1993年首次報道了我國的黑龍江大豆主產區發生大豆疫霉根腐病，此后在我國北方的大豆主產區陸續發現大豆疫霉的危害。目前每年給全球大豆生產造成的經濟損失超過10億美元^[8]。為了阻止大豆疫霉傳播范圍的不斷擴大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。?

傳統的檢測大豆疫霉的方法是進行大豆葉碟誘捕和平板培養或者將二者相結合^[1，10]。傳統方法在大豆疫霉檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗。隨著核酸相關的鑒定方法的發展，基于PCR的方法已經成功用于檢測大豆疫霉^[7]，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環裝置。其檢測靈敏度比較高，但是檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。?

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP）是日本的榮研株式會發明的一種新的核酸擴增技術^[4]，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優點，成為可以替代PCR的新的核酸擴增技術。它是針對靶基因的6個區域設計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60～65℃范圍60min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。?

靶標基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。以PCR技術檢測大豆疫霉菌是基于核糖體基因序列^[7]，但由于核糖體序列沒有足夠多的位點來區分所有的病原菌，因此開發出新的檢測靶標成為檢測的熱點。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro。?

本發明的另一目的是提供該大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro的其特異性LAMP引物組合物。?

本發明的又一目的是提供該大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其LAMP引物組合物的應用。?

本發明的目的可通過如下技術方案實現：?

大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro在檢測或鑒定大豆疫霉中的應用。?

針對所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物，分別為：正向內引物FIP：SEQ?ID?NO.2，反向內引物BIP：SEQ?ID?NO.3，正向外引物F3：SEQ?ID?NO.4，反向外引物B3：SEQ?ID?NO.5。?

所述的針對所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物在檢測或鑒定大豆疫霉中的應用。?

一種用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。?

所述的用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，包含：由1.6μM正向內引物FIP、1.6μM反向內引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.4mM?dNTPs、20mM?pH?8.8的Tris-HCl、10mM?KCl、10mM(NH4)₂SO4、6mM?MgSO₄、0.1％Triton?X-100、8U?Bst?DNApolymerase?320單位、180mM羥基萘酚藍，加入超純水制備成檢測溶液。?