[發明專利]大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro及其特異性LAMP引物組合物和應用

有效

• 申請號: 201210153468.5
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102676511A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 王源超;戴婷婷;董莎萌;鄭小波
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro在檢測或鑒定大豆疫霉中的應用。

3.針對權利要求1所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物，其特征在于包含：正向內引物FIP：SEQ?ID?NO.2，反向內引物BIP：SEQ?ID?NO.3，正向外引物F3：SEQ?ID?NO.4，反向外引物B3：SEQ?ID?NO.5。

4.權利要求3所述的針對權利要求1所述的大豆疫霉的檢測靶標序列A3apro設計的特異性的LAMP引物組合物在檢測或鑒定大豆疫霉中的應用。

5.一種用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包含權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物。

6.根據權利要求5所述的用于檢測大豆疫霉的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含：由1.6μM正向內引物FIP、1.6μM反向內引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.4mM?dNTPs、20mM?pH?8.8的Tris-HCl、10mM?KCl、10mM(NH4)₂SO4、6mM?MgSO₄、0.1％Triton?X-100、8U?Bst?DNA?polymerase?320單位、180mM羥基萘酚藍，加入超純水制備成檢測溶液。

7.一種檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP；

擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特征性梯狀條帶，則證明存在大豆疫霉；

或者以LAMP反應體系的顏色變化做為結果判定標準，天藍色表示檢測為陽性，存在大豆疫霉；紫色表示檢測結果為陰性，不存在大豆疫霉。

8.根據權利要求7所述的檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待檢微生物的DNA，取1μl?DNA溶液，加入23μl權利要求6所述的檢測溶液和2μl滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應程序為：60℃～65°C,55～90min，優選64℃,80min；

擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，如果存在特征性梯狀條帶，則證明存在大豆疫霉；

或者以LAMP反應體系的顏色變化做為結果判定標準，天藍色表示檢測為陽性，存在大豆疫霉；紫色表示檢測結果為陰性，不存在大豆疫霉。