[發(fā)明專利]快速提取大量樣品微量DNA的方法及其在利用SSR標(biāo)記鑒定作物雜交種純度上的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210153442.0
• 申請日: 2012-05-17
• 公開（公告）號: CN102676504A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王玉剛;馮輝;李承彧;劉志勇;冀瑞琴;聶子靜;薛一花
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種快速提取大量樣品微量DNA的方法及其在作物SSR標(biāo)記雜交種純度鑒定上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雜交種獲得了廣泛應(yīng)用，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。種子作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子純度是保證農(nóng)作物品種增產(chǎn)潛力得以發(fā)揮的關(guān)鍵因素,?開展種子純度鑒定對保證種子質(zhì)量具有重要意義。常規(guī)田間鑒定方法一直是各育種單位采用的方法，但此法周期長、工作量大且易受環(huán)境條件影響，有一定風(fēng)險，造成種子積壓，影響種子推廣銷售。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,?DNA?分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛，國際植物新品種保護聯(lián)盟在BMT分子測試指南中，已將構(gòu)建DNA指紋的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP，其中SSR標(biāo)記因其技術(shù)比較成熟，穩(wěn)定性重復(fù)性好，可操作性強，已成為當(dāng)前各個作物進行分子標(biāo)記鑒定的首選。

CTAB法提取植物DNA，已為廣大科研工作者所熟知，是目前各試驗室應(yīng)用最廣泛且最為成熟的DNA提取法，具有實用、穩(wěn)定、價格低廉等特點。常規(guī)提取方法大多用1.5ml或2ml的離心管進行提取，獲得基因組DNA較多，可以進行幾十次至上百次左右試驗。但通常情況下，雜交種純度鑒定所用DNA只需要進行1次PCR的DNA量即可滿足要求，常規(guī)方法浪費嚴(yán)重，效率低。

對雜交種進行分子標(biāo)記純度鑒定時，常常需要在短時間內(nèi)提取大量樣本的微量DNA進行PCR檢測。提取效率高低、成本多少已經(jīng)成為制約該技術(shù)應(yīng)用的最大限制因素。

因此，尋找一種快速、高效、穩(wěn)定、成本低廉能夠滿足SSR技術(shù)要求的作物基因組DNA提取方法成為當(dāng)前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種快速、高效、穩(wěn)定、成本低的適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的微量基因組DNA提取方法。

本發(fā)明提供的一種快速提取大量樣品微量DNA的方法，包括如下步驟：

1）取深孔板1個，每孔加1-1.5克石英砂，再加入1個直徑3mm?的小鋼珠球，將幼葉或根尖放入深孔板的每個孔中，利用排槍向每孔中加入CTAB提取液100ul，蓋上板蓋，利用研磨機進行研磨，每秒25-30次，研磨2-3分鐘；

2）將深孔板放入65℃水浴10?min，水浴后1500?r/min?離心1?min，然后加入100ul的氯仿和異戊醇混合液，混合液的兩者體積比為24：1，蓋上板蓋，輕輕混勻；

????3）4000?r/min離心10?min，取上清液30ul，轉(zhuǎn)移至新的普通PCR板中，加入20ul在?-20℃下預(yù)冷的異丙醇，蓋上PCR板板蓋；

4）4000?r/min離心10?min，快速翻轉(zhuǎn)PCR板，傾倒試管中的全部液體，將試管板在多層干燥的吸水紙上不同的位置吸濕2-3?次，以吸去多余的液體；晾干后，加入30ul的TE溶液。-4℃保存?zhèn)溆眉纯伞????

本發(fā)明快速提取大量樣品微量DNA的方法在SSR標(biāo)記鑒定作物雜交種純度上的應(yīng)用，其特征是：DNA所涉及作物為黃瓜、大白菜、西瓜。

本發(fā)明具有如下積極效果：

1、本發(fā)明所述的基因組DNA提取方法，所用試劑為常規(guī)CTAB方法涉及的試劑，為大家所熟知。所涉及儀器設(shè)備也為通用的，易于推廣應(yīng)用。

2、本發(fā)明在DNA提取過程中減少了藥品用量，提取成本降低。

3、本發(fā)明DNA提取過程中，全部使用排槍（多孔道進樣器），大大提高DNA提取效率。

4、本發(fā)明所獲得DNA直接放于PCR板中，在進行PCR擴增試驗時，可直接利用10ul排槍進行操作（省去分裝DNA過程）,方便易行，提高效率。

附圖說明

圖1是提取西瓜根尖基因組DNA?0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖片。

圖2是提取大白菜葉片基因組DNA?0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖片。

圖3是提取黃瓜葉片基因組DNA?0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖片。

圖4是白菜SSR-PCR擴增后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析圖片。

圖5是西瓜SSR-PCR擴增后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析圖片。

具體實施方式

1）取96孔深孔板1個，每孔加1-1.5克石英砂，再加入1個直徑3mm?的小鋼珠球，將黃瓜、大白菜或西瓜幼葉或根尖放入96孔深孔板的每個孔中，利用8道或12道排槍每孔中加入CTAB提取液100ul，蓋上板蓋。研磨儀研磨，每秒25-30次，研磨2-3分鐘。