[發明專利]水稻miR399d 及其應用

無效

• 申請號: 201210153296.1
• 申請日: 2012-05-17
• 公開（公告）號: CN102676525A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 明鳳;張璇;呂波;金津;張睿
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01H5/00;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種水稻miR399d（簡寫為OsmiR399d）及其應用。?

背景技術

水稻是世界上主要的糧食作物之一。我國水稻土壤地域主要集中在長江中下游平原、四川盆地、珠江三角洲和臺灣省西部平原地區。這些地區多為酸性和微酸性土壤，土壤中磷素形態主要是磷酸鐵，水稻土的磷酸鐵含量一般可達非閉蓄態部分的50-80%（中國土壤，1978），此種形態的磷難于被作物吸收。水稻土磷肥短缺的現狀，大大限制了水稻產量，因而改善水稻磷營養特性，對于提高水稻產量意義重大。

MicroRNA是由19-25個核苷酸組成的一類內源性編碼單鏈小RNA(Dreyfuss?等,?2002；Gebauer?和?Hentze,?2004；Ambros,?2004)。這類內源性小分子RNA通過堿基互補配對原則結合于靶基因mRNA的側翼區域或編碼區域，從而調控靶基因的表達(Dreyfuss?等,?2002；Gebauer等,?2004；Ambros等,?2004)。低磷養分下，miR399在擬南芥和水稻中都被證實大量誘導表達（Chiou等，2006；Bari等，2004）。此家族在擬南芥和水稻中分別有6個（Sunkar?等,?2004;?Jones?等,?2004）和11個拷貝（Lopez等，2004）。報道表明在擬南芥中miR399參與了磷素短缺反應。miR399作用于泛素結合酶（UBC24），進而調控磷酸轉運蛋白，在磷素動態平衡中起著重要作用（Fujii等，2005;?Chiou等，2006;?Bari等，2006）。目前關于miRNA399與磷素脅迫的研究多集中于擬南芥中，對于水稻，單子葉模式作物的研究知之甚少，因此有進一步深入研究的必要性。?????miR399不僅和低磷響應相關，還受到鹽脅迫的誘導。芯片數據表明，白楊和玉米經過鹽處理后，miR399的表達上調（Ding等，2009；Jia等，2009）。而擬南芥中的miR399的表達在鹽處理前后沒有明顯變化（Fujii等，2005），說明不同物種中，microRNA的調控存在差異。水稻的miR399是否受鹽脅迫調控，還沒有報道。

本實驗室通過設計引物成功從日本晴全基因組序列中首次獲得水稻miR399d（以后簡寫為OsmiR399d）的前體基因，并將其轉入日本晴，獲得了過表達植株，過表達植株中磷含量過高，表現出磷中毒，說明OsmiR399d在水稻磷動態平衡調控中有一定作用。本實驗室還通過半定量和定量PCR研究了缺磷和鹽脅迫對OsmiR399d表達的影響，二者都能誘導OsmiR399d前體的表達,說明OsmiR399d可能不僅參與磷動態平衡調控，還與鹽脅迫反應有關。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從水稻種克隆出的OsmiR399d前體基因及其應用。具體包括：在水稻中表達的microRNA，OsmiR399d基因的克隆，克隆及檢測表達模式所需的引物序列，表達載體的構建，轉基因植株的獲得，基因水稻中磷含量的測定，對miR399d基因在缺磷脅迫和鹽脅迫處理后表達模式變化進行分析鑒定所用的方法，及其作用的靶基因的驗證。

本發明首先提供一種分離出的DNA分子，該DNA分子為首次從水稻中克隆出的OsmiR399d前體基因，全長428bp，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。

本發明研究水稻miR399d對非生物脅迫例如缺磷脅迫、鹽脅迫的響應，表明水稻miR399d對非生物脅迫例如缺磷脅迫、鹽脅迫的響應，誘導效果明顯。

本發明通過將水稻OsmiR399d前體基因在水稻中過表達，獲得轉基因植株，并驗證水稻miR399d的功能。

本發明提供用于從日本晴全基因組序列中，根據miR399d前體莖環兩端特異性區域設計的擴增OsmiR399d基因的引物對：

miR399d?正向：GCAGATCTGTAGGAAGACAAGAGGCAAGT?（SEQ?ID?NO.2）

miR399d?反向：GCGGTGACCGGGGCTAAACTCCTAAACA??（SEQ?ID?NO.3）

本發明提供用于RealtimePCR定量檢測OsmiR399d表達的根據OsmiR399d前體莖環區域設計的引物對：?