[發明專利]水稻miR399d 及其應用

無效

• 申請號: 201210153296.1
• 申請日: 2012-05-17
• 公開（公告）號: CN102676525A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 明鳳;張璇;呂波;金津;張睿
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01H5/00;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

1.?一種分離出的DNA分子，其特征在于，為從水稻中克隆出的OsmiR399d前體基因，全長428bp，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

2.?一種基因組中含有如權利要求1所述DNA分子的轉基因水稻植株。

3.?一對用于調取水稻基因組中miR399d前體基因的引物，其特征在于，根據權利要求1所述基因莖環兩端區域設計，序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。

4.?一對RealtimePCR定量檢測水稻miR399d前體基因表達的引物，其特征在于，根據權利要求1所述基因莖環區域設計，序列如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5所示。

5.?一種檢測水稻基因OsmiR399d響應缺磷脅迫的方法，其特征是利用引物SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3，對缺磷處理的水稻cDNA樣品進行半定量PCR，檢測該基因在莖葉中的表達；樣品為水稻的RNA?經過逆轉錄后所得cDNA；其步驟如下：

（a）提取缺磷處理和正常培養水稻的總RNA；?

（b）利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA；

（c）利用引物對SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3，進行半定量PCR檢測。

6.?一種檢測水稻基因OsmiR399d響應鹽脅迫的方法，其特征在于鹽處理的水稻分別提取根和莖葉的總RNA，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA?，利用引物對SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.5對cDNA樣品進行定量PCR，檢測該基因在根和莖葉中的表達，結果顯示：OsmiR399d基因的前體受到鹽脅迫的誘導。

7.?一種驗證miRNA靶基因的方法，5’RACE，其特征在于在mRNA?5’端加上接頭，反轉錄成cDNA，用基因特異引物和接頭引物，擴增目的基因，獲得目的基因的5’端序列，結果顯示：OsPHO2的5’端與OsmiR399d成熟序列互補，是OsmiR399d的靶基因。

8.?一種測定水稻葉片中磷含量的方法，其特征在于提取根和莖葉中的可溶性磷，利用磷與鉬酸銨形成絡合物，然后被抗壞血酸還原成鉬藍，根據在820nm有吸收峰的原理，測定根和莖葉中的磷含量。

9.?如權利要求1所述的基因OsmiR399d在植物品種改良中的應用。