[發明專利]一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法

無效

• 申請號: 201210151606.6
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102676533A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張宏斌
• 申請（專利權）人: 廣州軍區廣州總醫院
• 主分類號: C12N15/15
• 分類號: C12N15/15;C12N15/70
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明屬于生物醫學工程領域，特別涉及一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法。

背景技術

胱抑素C?(cystatin?C,?Cys?C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，1983年Anastasi等首次在雞蛋清中分離純化得到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine?proteinase?inhibitor，CPI）后被命名為胱抑素C，也被稱為γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，廣泛存在于各種組織的有核細胞和體液中，是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質，分子量為13.3KD，由122個氨基酸殘基組成，可由機體所有有核細胞產生，產生率恒定。循環中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的內源性標志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，因此，其血中濃度由腎小球濾過決定，而不依賴任何外來因素，是一種反映腎小球濾過率變化的理想同源性標志物，可作為腎小球濾過功能指標，較目前常用的腎功能檢測項目有更高的靈敏度和特異性，其血清濃度測定是替代傳統的血尿素、肌酐(Cr)和內生肌酐清除率(Ccr)測定的首選腎功能評價指標。

由于Cys?C及其抗體的來源受限，現有檢測Cys?C的試劑盒價格昂貴，妨礙了其在國內推廣應用。目前，通常采用PCR技術調取Cys?C編碼基因，克隆后進行重組表達，但表達效率極低，難以滿足市場需要。為此我們重新設計了Cys?C的編碼基因，建立了重組Cys?C蛋白的制備體系，以期解決Cys?C的來源問題，為CysC檢測試劑盒的研發奠定基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法。

本發明所采取的技術方案為：

一種重組人胱抑素C編碼基因，其核苷酸序列如下：

5’-atgcgtggttctcatcatcaccatcaccacgctggtatcgaaggtcgttcctctccaggtaaaccgccacgtctggttggcggtccaatgg

atgcatccgtggaagaggaaggcgttcgtcgtgcactggactttgctgttggcgagtacaacaaagcgtccaatgacatgtatcactctcgtgctctgcaagtggttcgcgcacgcaagcagatcgtagcaggtgtgaactactttctggacgtagagctgggtcgcaccacttgcaccaaaacccagccgaatctggacaactgtccgttccatgaccaaccgcacctgaaacgcaaggcgttctgctcctttcagatctatgctgtaccatggcaaggcaccatgactctgtccaagtctacctgtcaggatgcgtaa-3’?（SEQ?ID?NO：1）。

重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟：

1)??將權利要求1所述的重組人胱抑素C編碼基因（目的基因）插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；

2)??工程菌經發酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。

優選的，步驟2）工程菌經發酵培養、IPTG誘導表達融合蛋白、收集菌體，破碎菌體，收集上清液，上清液經鎳層析柱純化，得重組人胱抑素C蛋白。

優選的，IPTG誘導表達融合蛋白的方法：待發酵培養的菌液OD_600nm在0.6～1.0，加入終濃度0.1～10??mmol/L的IPTG，30～40℃培養2～10?h。

優選的，重組人胱抑素C蛋白的表達方法包括如下步驟：

1)??將目的基因的兩端加入酶切位點，進行全序列合成，得合成基因序列；

2)??將合成基因序列克隆于T載體，測序確定成功構建重組T載體；

3)??將目的基因從重組T載體上切下，插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；

4)??工程菌經發酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。

優選的，目的基因兩端加入的酶切位點不相同。加上不同酶切位點要求在目的基因中不存在，同時是為了便與與載體相連，且使酶切的載體不會發生自身連接。

優選的，目的基因的序列內部不含有其兩端加入的酶切位點。

優選的，目的基因兩端加入的酶切位點與原核表達載體多克隆位點有相同的酶切位點，且酶切順序一致。