[發明專利]一種重組人胱抑素C編碼基因與表達方法

無效

• 申請號: 201210151606.6
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102676533A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張宏斌
• 申請（專利權）人: 廣州軍區廣州總醫院
• 主分類號: C12N15/15
• 分類號: C12N15/15;C12N15/70
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種重組人胱抑素C編碼基因，其核苷酸序列見SEQ?ID?NO：1。

2.重組人胱抑素C蛋白的表達方法，包括如下步驟：

1)將權利要求1所述的重組人胱抑素C編碼基因（目的基因）插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；

2)工程菌經發酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。

3.根據權利要求2所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：步驟2）工程菌經發酵培養、IPTG誘導表達融合蛋白、收集菌體，破碎菌體，收集上清液，上清液經鎳層析柱純化，得重組人胱抑素C蛋白。

4.根據權利要求3所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：IPTG誘導表達融合蛋白的方法：待發酵培養的菌液OD_600nm在0.6～1.0，加入終濃度0.1～10??mmol/L的IPTG，?30～40℃培養2～10?h。

5.根據權利要求2所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

1)將目的基因的兩端加入酶切位點，進行全序列合成，得合成基因序列；

2)將合成基因序列克隆于T載體，測序確定成功構建重組T載體；

3)將目的基因從重組T載體上切下，插入到原核表達載體的多克隆位點，構建重組表達質粒，將重組表達質粒轉化到表達宿主菌大腸桿菌，篩選出陽性克隆菌，得工程菌；

4)工程菌經發酵、誘導、分離、純化，得重組人胱抑素C蛋白。

6.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：目的基因兩端加入的酶切位點不相同。

7.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：目的基因的序列內部不含有其兩端加入的酶切位點。

8.根據權利要求5所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：目的基因兩端加入的酶切位點與原核表達載體多克隆位點有相同的酶切位點，且酶切順序一致。

9.根據權利要求5～8任一項所述的重組人胱抑素C蛋白的表達方法，其特征在于：目的基因的5’端加入NdeⅠ酶切位點，3’端加入EcoRⅠ酶切位點；原核表達載體為pET-22b(+)；表達宿主菌為E.coli?BL21(DE3)。