[發明專利]結構可控型丙烯酸類共聚物的合成方法及其在促堿性蛋白體外復性中的應用

無效

• 申請號: 201210150048.1
• 申請日: 2012-05-16
• 公開（公告）號: CN102675505A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 黃志鋒;劉白玲;牛建樓;葉朝輝;謝瑤瑤;宋林濤
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院;中國科學院成都有機化學有限公司
• 主分類號: C08F120/06
• 分類號: C08F120/06;C08F220/06;C08F220/04;C12N9/36;C07K14/475;C07K14/50;C07K1/14
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司 33211
• 代理人: 李友福

技術領域

本發明涉及生物基因工程中蛋白體外復性過程中使用的人工合成、模擬分子伴侶的高分子添加劑（人工分子伴侶），具體是涉及一種結構可控型丙烯酸類共聚物的合成方法及其在促堿性蛋白體外復性中的應用。

背景技術

基因工程使得大批具有藥用價值的重組蛋白類藥物在微生物表達體系中得到高水平表達，這推動了現代生物醫藥的發展。迄今為止，大腸桿菌以其操作簡單、容易培養、可大規模生產，依然是重組蛋白首選的表達系統。但正是由于大腸桿菌中缺乏后修飾體系，使得多種利用大腸桿菌表達的外源基因產物，如角質細胞生長因子KGF-1、白介素-24和人胰島素等，不能分泌到細胞外而是以無生物活性的蛋白聚集體（包涵體）形式存在。在后續步驟中，包涵體要經過提取、溶解、復性和純化等過程才能得到活性蛋白，這一過程在細胞外進行，又稱為蛋白質體外折疊。如何實現蛋白體外的正確折疊即高效的復性成為目前包涵體途徑生產活性蛋白所面臨的一個較為棘手的問題。

一般認為，蛋白體外復性存在兩類疏水相互作用力，即蛋白分子內和蛋白分子之間的疏水相互作用，前者促進蛋白的正確折疊而后者導致了蛋白的再聚集，因此抑制蛋白之間的疏水作用力以防止再聚集，從而提高蛋白復性效率。目前采取以下兩種方法促進蛋白體外折疊以獲得高效復性：（1）采用不同的工藝方法，如稀釋復性、反相微膠束、凝膠/離子/疏水色譜復性；（2）在折疊的過程中加入輔助試劑，如精氨酸、低分子量糖類、表面活性劑、天然分子伴侶和人工合成的分子伴侶。分子伴侶往往與變性蛋白形成復合物來抑制蛋白聚集體的形成，且隨著蛋白的折疊而發生解離。到目前為止，分子伴侶是蛋白折疊輔助試劑中最有效的一類物質。但是在體外復性時候，體外的環境往往使分子伴侶失去活性。因此，人們努力尋找一種能夠起到與分子伴侶類似功能的添加劑。目前高分子添加試劑，如聚乙二醇、聚（N-異丙基丙烯酰胺）、尤特奇?S-100（甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物，其中甲基丙烯酸：甲基丙烯酸甲酯=?1：2），能夠起到類似作用即體外折疊過程中抑制蛋白再聚集。

在蛋白體外復性過程中使用人工合成的、模擬分子伴侶的高分子添加劑（人工分子伴侶），這種方法使得在高濃度下得到較高的蛋白復性產率，從而便于工業化生產，已得到廣泛關注。研究者已經將聚乙二醇（PEG）和聚氧化乙烯-苯基-聚乙二醇應用于蛋白復性中，發現此類兩親性聚合物能夠與蛋白折疊中間體通過疏水作用力形成復合物，從而抑制蛋白再聚集以提高蛋白復性率。此外，研究者發現溫敏性聚（N-異丙基丙烯酰胺）和pH敏感聚合物尤特奇?S-100不僅促進蛋白復性，且通過調節溫度或者pH實現蛋白的高效分離和純化，這無疑大大地簡化了蛋白復性的后續純化步驟。

丙烯酸類共聚物是一大類聚合物即丙烯酸與其他共聚單體聚合而得的共聚物，它具有很好的分散作用，同時熱穩定和化學穩定性高，通常作為一種高分子分散劑用作顏料分散劑、護膚品添加劑、水質穩定劑、皮革助劑等。常見的丙烯酸類共聚物有丙烯酸-丙烯酸酯類共聚物、丙烯酸-磺酸鹽共聚物、丙烯酸-苯乙烯等。從其應用層面考慮，傳統應用（顏料分散劑、護膚品添加劑、水質穩定劑、皮革助劑）并沒有對其合成方法和化學結構表征提出較為嚴格的的要求。該發明合成的丙烯酸類共聚物（丙烯酸-α-烷基丙烯酸或者α-烷基丙烯酸中不同的兩類共聚）未見報道。

通過對于以往高分子材料在蛋白上的應用可以發現疏水性與靜電相互作用在此過程中發揮了至關重要的作用，而丙烯酸類共聚物（丙烯酸-α-烷基丙烯酸或者α-烷基丙烯酸中不同的兩類共聚）能夠滿足這些條件：（1）改變共聚單體的α-烷基或者共聚單體的比例可以獲得不同疏水性的共聚物從而滿足不同蛋白復性的需要；（2）丙烯酸共聚物側基-COOH作為靜電作用力的位點從而發揮促進蛋白復性的效果；（3）丙烯酸共聚物的分子量影響其體積排除效應，從而影響蛋白復性。由此可見，丙烯酸共聚物的可控合成對于其發揮促蛋白復性的重要性。而現有的丙烯酸類共聚物制備方法局限于乳液聚合，并且該制備方法無法實現對合成的丙烯酸類共聚物的結構進行控制。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種合成該類結構可控型丙烯酸類共聚物的方法，以及將此類共聚物應用于蛋白復性，解決蛋白復性效率低效的問題，所謂的可控型是指對合成的丙烯酸類共聚物中各種共聚單體所占的比例及共聚物的分子量可控。

為達到上述目的，本發明公開了一種結構可控型丙烯酸類共聚物的合成方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：