[發明專利]一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210149201.9
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102731658A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 王鳳山;張新科;程艷娜;譚海寧;李妍
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N15/70;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00;A61P9/00;A61P27/02
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明提供了一種Tat?PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應用，屬于蛋白轉導領域。?

背景技術

內皮抑素（Endostatin，ES）是1997年O′Reilly等首次發現的一種內源性血管內皮細胞增殖的強效抑制劑。研究發現，ES可特異性抑制新生血管內皮細胞的生成，并對多種起源的新生血管內皮細胞生成有抑制作用，且不影響靜止的血管內皮細胞，無耐藥性，毒副作用小。我國已將血管內皮抑素衍生物研制成具有自主知識產權的國家一類新藥Endostar(恩度，YH16)，用以治療非小細胞肺癌。此外研究者們在ES防治眼部新生血管性疾病方面也取得一些可喜的成就。但是ES仍舊存在一些缺點，由于其體內半衰期短，入胞能力差，臨床上的使用劑量較大，增加了患者的經濟負擔。如果能夠通過一定的手段提高其穩定性、延長其體內半衰期、并增加其入胞能力達到提高其體內活性從而減少給藥劑量或延長給藥周期，將會大大提高ES的治療效果，促進其在臨床上的應用。?

能夠穿透細胞膜的Tat蛋白可能幫助解決使藥物透過眼球屏障進入作用部位問題。Tat蛋白來源于人類免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活因子，1988年Maurice和Paul發現Tat蛋白能夠跨膜遞送入細胞，1997年Vives等證明Tat蛋白中有一段富含堿性氨基酸、帶有正電荷的多肽片段（Tat蛋白中47-57位氨基酸序列片段）與其轉導功能密切相關，并稱之為Tat蛋白轉導域（PTD），其序列是YGRKKRRQRRR。到目前為止研究表明，Tat?PTD能夠運載蛋白多肽、外源基因、脂質體、無機分子等多種物質有效進入細胞內。與其他運輸載體相比，TatPTD具有其優越性：（1）轉導效率不受連接物大小的限制，且對其運輸的“貨物分子”的活性不產生影響；（2）在一定范圍內不會造成細胞損傷，不具有明顯的免疫原性、抗原性和致炎性；（3）能穿透血腦屏障，有望解決大分子藥物進入生物屏障結構發揮療效的問題。此外，Tat?PTD與大分子蛋白質相連以后，從結構上來看，也可以理解為對大分子蛋白質進行了一定的化學修飾，延長了肽鏈，有望增加蛋白質的穩定性，延長生物半衰期，也有利于提高其在治療腫瘤等疾病的療效。?

本發明利用穿膜肽Tat?PTD的穿膜作用和內皮抑素的抑制新生血管的生成作用，將二者通過基因工程的手段融合在一起，以期獲得能夠穿透細胞膜甚至是血腦屏障或眼球屏障的內皮抑素，達到通過簡單的局部滴眼給藥預防眼部血管增生的目標。這一研究對探索大分子蛋?白質眼部給藥的新途徑和視網膜脈絡膜病變的防治具有重要意義。?

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種Tat?PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：?

一種Tat?PTD-Endostatin重組蛋白，是由人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活轉導蛋白Tat的蛋白轉導域和人內皮抑素構成的融合蛋白，其中，人類免疫缺陷病毒的反式激活轉導蛋白Tat的蛋白轉導域（Tat?PTD）的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，人內皮抑素（Endostatin）的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

本發明還提供了能夠表達Tat?PTD-ES融合蛋白的DNA序列，其具有SEQ?ID?NO.3(Tat?PTD)和SEQ?ID?NO.4(Endostatin)所示的序列或編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡并性的序列。?

所述Tat?PTD-Endostatin重組蛋白可以通過酵母或大腸桿菌體系表達，方法如下：?

采用酵母表達Tat?PTD-Endostatin重組蛋白的方法，步驟如下：?

（1）常規方法制備含有編碼Tat?PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的TatPTD-ES融合基因，并擴增；?

（2）用限制性內切酶EcoR?Ⅰ、Not?Ⅰ分別酶切質粒pGAPZαA和Tat?PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產物，然后用T4DNA連接酶連接；?

（3）上述連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測序分析鑒定重組質粒pGAPZαA/Tat?PTD-Endostatin，最終獲得重組表達質粒pGAPZαA/Tat?PTD-Endostatin；?