[發(fā)明專利]一種Tat PTD-Endostatin重組蛋白及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210149201.9
• 申請日: 2012-05-15
• 公開（公告）號: CN102731658A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王鳳山;張新科;程艷娜;譚海寧;李妍
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N15/70;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00;A61P9/00;A61P27/02
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種TatPTD-Endostatin重組蛋白，其特征在于：是由人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域和人內(nèi)皮抑素構(gòu)成的融合蛋白，其中，人類免疫缺陷病毒的反式激活轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，人內(nèi)皮抑素的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.一種表達(dá)Tat-ES融合蛋白的DNA序列，其特征在于：其具有SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的序列或編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡并性的序列。

3.一種采用酵母表達(dá)Tat?PTD-Endostatin重組蛋白的方法，其特征在于：步驟如下：

（1）常規(guī)方法制備含有編碼Tat?PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的Tat?PTD-ES融合基因；

（2）用限制性內(nèi)切酶EcoR?Ⅰ、Not?Ⅰ分別酶切質(zhì)粒pGAPZαA和Tat?PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接；

（3）上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pGAPZαA/Tat?PTD-Endostatin，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA/Tat?PTD-Endostatin；

（4）制備感受態(tài)的酵母菌GS115，重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA/Tat?PTD-Endostatin單酶切線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)的GS115菌中，在含Zeocin的LB平板上培養(yǎng)2-3天篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；

（5）上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為Tat?PTD-Endostatin重組蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（4）中的酵母菌株為畢赤酵母或釀酒酵母。

5.一種采用大腸桿菌表達(dá)Tat?PTD-Endostatin重組蛋白的方法，其特征在于：步驟如下：

（1）常規(guī)方法制備含有編碼Tat?PTD的目的基因和編碼Endostatin的目的基因的Tat-ES融合基因，并擴增；

（2）用限制性內(nèi)切酶Nde?Ⅰ、BamH?Ⅰ分別酶切質(zhì)粒pET28a和Tat?PTD-ES融合基因，并分別回收酶切產(chǎn)物，然后用T4DNA連接酶連接；

（3）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測序分析鑒定重組質(zhì)粒pET28a/Tat?PTD-Endostatin，最終獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a/Tat?PTD-Endostatin；

（4）制備感受態(tài)的大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)化入Rossetta感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)16h，篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；

（5）上述陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵，分離純化得到發(fā)酵產(chǎn)物，鑒定發(fā)酵產(chǎn)物，即為Tat?PTD-Endostatin重組蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述步驟（5）具體如下：

①挑選陽性轉(zhuǎn)化子，過夜培養(yǎng)后，按1：100接入LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8-1.0，加入IPTG，37℃，200r/min，誘導(dǎo)6h，收菌；

②將菌體破壁，采用SDS-PAGE對目的蛋白進(jìn)行鑒定；

③包涵體復(fù)性：菌體超聲后離心得包涵體，采用稀釋復(fù)性或透析復(fù)性或超濾復(fù)性法對包涵體進(jìn)行復(fù)性；

④分離純化Tat?PTD-Endostatin融合蛋白：將復(fù)性成功的蛋白質(zhì)經(jīng)親和層析或離子交換層析進(jìn)行純化，除鹽后得目的蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述③中復(fù)性的具體方法如下：菌體破壁后，10000g離心30min，棄去上清得到包涵體；采用含去污劑的尿素或鹽酸胍溶液洗滌多次去除粘附的雜蛋白；采用變性液對包涵體進(jìn)行溶解，在室溫攪拌2h后，10000g離心30min，上清為包涵體溶液；然后，將包涵體溶解的、變性的無生物活性的蛋白質(zhì)復(fù)性，使其能夠折疊形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述④中，采用G25-Sephadex、超濾或透析的方法除鹽。