[發明專利]一種梅花染色體周年性制片方法

有效

• 申請號: 201210146739.4
• 申請日: 2012-05-11
• 公開（公告）號: CN102768131A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 張啟翔;陳晶鑫;楊煒茹;孫麗丹
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及植物染色體制片方法，具體是一種梅花染色體周年性制片方法。

背景技術

梅花(Prunus?mume?Sieb.et?Zucc.)是重要的木本花卉，對梅花進行染色體層面的研究，是對其進行基因定位、構建物理圖譜的重要前提。然而受限于木本植物，其染色體層面的研究極其局限。

現有文獻記載，梅的染色體數目據國外Okabe(1927，1929)報道是2n＝16、24，Oginuma等(1987，1989)發表是2n＝16。在國內，主要是黃哲(1989)首次對梅花的染色體進行了研究，黃燕文、包滿珠等(1995)對野梅、果梅和花梅染色體的數目及形態進行了研究，林盛華、褚孟嫄(1999)對梅花染色體進行了研究，鑒定梅品種資源的倍數性，為梅分類起源和遺傳育種提供細胞學依據。他們所采用的試驗材料主要是花后新芽及冬季休眠枝條水培萌發的新芽，取材周期短，時間受限。

染色體顯帶、熒光原位雜交等技術需要大量的重復實驗對結論進行驗證，而使用傳統的莖尖材料進行染色體制片，取材方便，分裂相豐富，雖然能夠滿足染色體計數及常規核型分析的需要，但若需要進行大量重復實驗，傳統的取材方法無法對材料進行長期保存，無法滿足大量重復實驗的要求，因而嚴重阻礙了梅花染色體的深入研究。

發明內容

為了解決梅花染色體研究過程中染色體制片取材周期短、時間受限的問題，本發明提供一種梅花染色體周年性制片方法。

本發明所述梅花染色體周年性制片方法，根據時間選取如下分生組織作為制片材料：

1)春季，梅花早春枝條新發莖尖；2)初夏，梅花未成熟胚，以及梅花未成熟胚組織培養所得生長點；3)夏、秋，梅花一年生實生苗頂端生長點；4)冬季，梅花休眠枝條水培所得莖尖。

其中，所述的梅花早春枝條新發莖尖，為梅花葉芽正常萌動伸長時，剝去鱗片及大葉，所取得的萌發莖尖。

其中，所述的梅花未成熟胚，為授粉后25～35天，用石錘除去梅花果實的果肉，打開果核取出種子，所取的未成熟胚。

其中，所述的梅花未成熟胚組織培養所得生長點，為以6-BA濃度是1mg/L、IBA濃度是0.2mg/L的MS培養基進行梅花組織培養，暗培養一周，胚伸長時，切取的0.5cm伸長部位作為梅花未成熟胚組織培養所得生長點。

其中，所述的梅花一年生實生苗頂端生長點，為于第一年8月初對梅花種子進行2℃低溫沙藏，55-65天后梅花種子發芽，播種栽培于溫室，次年4月中旬移栽至大田，同時對梅花一年生實生苗進行修剪，待分枝后，于上午切取一年生枝條頂端生長點作為梅花一年生實生苗頂端生長點。

其中，切取梅花一年生枝條頂端生長點的時間為上午9:00～11:00。

其中，所述的梅花休眠枝條水培所得莖尖，為于11月中旬取一年生枝條蠟封處理，4℃低溫保存一個月后水培，一周后發芽，所取的萌發莖尖。

本發明所述的梅花染色體周年性制片方法，包含以下步驟：

(1)所取制片材料用卡諾固定液低溫4℃固定20h以上，作為固定后的材料待用；

(2)配制纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分含量為2.0～2.5％，果膠酶的重量百分含量為2.0～2.5％；

(3)將步驟(1)中固定后的材料用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解時間長度90～150min，作為酶解后的材料待用；

(4)將酶解后的材料進行壓片法制片。

其中，步驟(2)所述配制纖維素酶和果膠酶的酶溶液，纖維素酶的重量百分含量優選2.38％，果膠酶的重量百分含量優選2.38％。

其中，步驟(3)所述用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解，酶解溫度優選37℃，酶解時間長度優選110min。

本發明利用梅花不同時期的分生組織進行制片，克服了以往的梅花染色體制片取材受限于冬季及早春的時間限制，實現周年性制片。梅花染色體周年性制片方法克服了傳統取材的時間限制，周期長，取材靈活，制片效果良好，有利于梅花染色體深入研究。

附圖說明

圖1：梅花粉瓣早春枝條新發莖尖染色體100倍油鏡鏡檢圖像。

圖2：梅花粉瓣未成熟胚染色體100倍油鏡鏡檢圖像。

圖3：梅花粉瓣未成熟胚組織培養所得生長點染色體100倍油鏡鏡檢圖像。

圖4：梅花粉瓣一年生實生苗頂端生長點染色體100倍油鏡鏡檢圖像。

圖5：梅花粉瓣休眠枝條水培所得莖尖染色體100倍油鏡鏡檢圖像。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。