[發明專利]一種基于微懸臂梁的檢測殺蟲晶體蛋白Cry1Ab的方法

有效

• 申請號: 201210146515.3
• 申請日: 2012-05-11
• 公開（公告）號: CN102778569A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 吳驪珠;彭榮鵬;陳彬;佟振合
• 申請（專利權）人: 中國科學院理化技術研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及一種基于微懸臂梁檢測殺蟲晶體蛋白Cry1Ab的方法，具體涉及一種微懸臂梁表面修飾殺蟲晶體蛋白Cry1Ab抗體的方法及應用。?

背景技術

Cry1Ab蛋白是一種源于蘇云金桿菌[Bacillus?Thuringiensis(Bt)]的基因表達的毒蛋白。蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌,是一類對害蟲毒力強、致死速度快且對害蟲天敵無毒性的昆蟲病原微生物。菌體在穩定生長期可形成伴胞晶體蛋白,又稱殺蟲晶體蛋白(ICP)或D2內毒素。ICP由Cry基因和Cyt基因編碼,對敏感昆蟲有較強毒性,而對高等動物和人無毒性。CrylAb屬于Cry基因家族,是Bt基因表達的毒蛋白(Microbiol.Rev.1989,53,242)。Bt在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中已成為化學合成農藥的有力替代品,它還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。對Bt蛋白快速、準確地測定,將為育種、轉基因植物的蟲害管理和基因標識提供技術支撐。目前常見的Bt蛋白檢測方法有基于核酸DNA檢測的PCR法(Anal.Bioanal.Chem.2003,373,985)和基于蛋白檢測的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)(Nature,1999,402,480)，PCR法能夠從作物種子開始到作物成熟整個過程中對轉基因成分進行精確測定，不受樣品的處理方法的影響，但容易出現假陰性和假陽性等問題，對于經過高度處理的轉基因產品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等，它們不含任何DNA成分，因此PCR法很難實現對此類轉基因食品的檢測；酶聯免疫吸附檢測是基于抗原和抗體的特異性結合以及酶底物的高效催化特性的一種快速檢測技術，具有快速、靈敏、準確、低成本等特點，己能定性又能定量檢測目標轉基因蛋白。但該方法需要進行熒光標記，操作復雜。而微懸臂梁基于表面應力的改變來檢測抗原和抗體的特異性結合，無需標記，操作簡單，且靈敏度更高。?

微懸臂梁生化傳感技術是近年來伴隨著掃描探針顯微鏡（SPM）和微機電系統（MEMS）迅速發展起來的一種新興技術。當有生化反應在微懸臂梁的單側表面發生時，其表面應力的改變會導致微懸臂梁產生彎曲變形，通過光學或電學讀出方法可以測量變形值（Nat.Biotech.2001,19,856;Chem.Rev.2008,108,522）。和傳統的ELISA方法相比，基于抗體修飾的微懸臂梁免疫傳感技術具有以下優點：無需標記、靈敏度高、容易實現實時在線的大尺度、高通量、平行陣列測量，可能潛在地用于替代現有的酶聯免疫吸附檢測方法，對轉基因?物種的分析檢測具有十分重要的意義。目前基于微懸臂梁的免疫傳感器主要是用于檢測PSA（Biosens.Bioelectron.,2005,20,2157）、CRP（Biosens.Bioelectron.,2004,20,269）、scFv(Proc.Natl.Acad.Sci.,2005,102,14587)、IgG（Biosens.Bioelectron.,2005,21,597）、myoglobin(Sens.Actuators,B2006,117,332)和GST(Nanotechnology,2007,18,125503)等等，但到目前為止，還沒有任何專利和文獻報道基于微懸臂梁的檢測轉基因蛋白（如殺蟲晶體蛋白Cry1Ab）的方法。?

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供一種新型無標記、高靈敏度、高特異性的基于微懸臂梁的檢測殺蟲晶體蛋白CrylAb的方法。?

為解決上述技術問題，本發明開發了一種基于微懸臂梁的檢測殺蟲晶體蛋白Cry1Ab的方法，包含以下步驟：?

將帶金膜的微懸臂梁進行前處理，浸入巰基化試劑的醇類溶液中，使巰基化試劑修飾到微懸臂梁的金膜上，清洗；所述清洗包括用乙醇清洗，氮氣吹干；?

將微懸臂梁浸入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液中，使巰基化試劑的羧基活化，清洗；所述清洗包括用去離子水清洗，用生物緩沖溶液清洗；?

將微懸臂梁浸入殺蟲晶體蛋白Cry1Ab抗體的生物緩沖溶液中，所述生物緩沖溶液包括pH?7.4的PBS緩沖液，靜置，使活化后的羧基和殺蟲晶體蛋白Cry1Ab抗體的氨基結合。?

將上述修飾有Cry1Ab抗體的微懸臂梁用于對殺蟲晶體蛋白Cry1Ab的檢測。?