[發(fā)明專利]通過定向進(jìn)化構(gòu)建的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210145503.9
• 申請(qǐng)日: 2010-08-13
• 公開（公告）號(hào): CN102653743A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻曉蔚;徐巖;王睿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過定向進(jìn)化構(gòu)建的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，具體地說涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪酶（EC?3.1.1.3）不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業(yè)中。微生物是脂肪酶的一個(gè)重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產(chǎn)菌。如今，已有超過30種根霉脂肪酶實(shí)現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置選擇性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在較高溫度下進(jìn)行，而根霉脂肪酶屬于中溫脂肪酶，在65℃下的半衰期僅有15?min左右，熱穩(wěn)定性差不僅限制了其應(yīng)用范圍，而且易于失活，增加了生產(chǎn)成本。

定向進(jìn)化屬于非理性設(shè)計(jì)，是指通過在實(shí)驗(yàn)室中模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化過程，針對(duì)某一蛋白質(zhì)酶的基因，通過改進(jìn)的誘變技術(shù)改造的酶的基因，然后根據(jù)特定的改造目的，篩選有價(jià)值的天然酶。近10年來，定向進(jìn)化技術(shù)已經(jīng)在酯酶和脂肪酶性質(zhì)改造領(lǐng)域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反應(yīng)活性，改進(jìn)底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對(duì)映立體選擇性等方面（Johannes?TW?et?al.?Curr.?Opin.?Microbiol,?2006,?9:?261-267）。?

發(fā)明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉（Rhizopus?chinensis?）CCTCC?M?201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并實(shí)現(xiàn)該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）中的高水平分泌表達(dá)（Yu?Xiao-Wei?et?al.?J?Mol?Catal?B:?Enzym,?2009,?57:304-311）。本發(fā)明以華根霉脂肪酶基因?yàn)槟０澹枚ㄏ蜻M(jìn)化技術(shù)獲得了熱穩(wěn)定性顯著提高的脂肪酶突變體。

酶分子的熱穩(wěn)定性提高可以用其半衰期（t₅₀）來體現(xiàn)。即酶的活力降低到原來活力一半時(shí)所需要的時(shí)間。半衰期長，則酶穩(wěn)定性高。反之，則穩(wěn)定性差。因此，t₅₀的提高代表了酶分子熱穩(wěn)定性的提高。

????定義：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認(rèn)IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認(rèn)IUPAC命名法。

脂肪酶突變體的標(biāo)識(shí)

采用?“原始氨基酸?位置?替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸。如?Glu107Gly，?表示位置107的氨基酸由親本脂肪酶的Glu替換成Gly，位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于附件序列表1?中親本華根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列編號(hào)。

如?Leu180His/?Thr218Ser，表示位置180和位置218的氨基酸都發(fā)生了突變。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供通過定向進(jìn)化構(gòu)建的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體。

本發(fā)明的技術(shù)方案：通過定向進(jìn)化構(gòu)建的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，由親本華根霉（Rhizopus?chinensis?）CCTCC?M?201021脂肪酶進(jìn)行定向進(jìn)化，通過易錯(cuò)PCR、DNA?Shuffling和定點(diǎn)突變，獲得脂肪酶突變體，親本華根霉氨基酸序列SEQ?ID?NO:?1中在氨基酸取代位置發(fā)生突變，采用“原始氨基酸-位置-替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸，所述脂肪酶突變體為：，

表1

華根霉脂肪酶氨基酸突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?2，有22個(gè)突變氨基酸，底色標(biāo)記顯示。

用于表達(dá)所述的脂肪酶突變體的表達(dá)載體為：pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα，pPICZ；

用于所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞為畢赤酵母。

與親本華根霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性獲得了提高，以在65℃下的半衰期t₅₀來表示熱穩(wěn)定性的提高，所述脂肪酶突變體的半衰期以及提高的倍數(shù)如下：?

表2

親本華根霉脂肪酶在65℃下的半衰期t₅₀為16.5?min。