[發明專利]一株抑制生物胺產生的棒狀乳桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201210145209.8
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102703345A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 陳堅;馮婷婷;方芳;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23C9/12;A23L1/314;A23L1/318;C12R1/225
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一株棒狀乳桿菌，特別是一株非生物胺產生乳酸桿菌。?

背景技術

生物胺（Biogenic?amines，BA）是生物體內產生的一類低分子量含氮有機化合物的總稱。它們是生物體合成荷爾蒙、核苷酸、蛋白質的前體，因此生物體自身合成的適量生物胺具有促進生長、增強代謝活力，加強腸道免疫系統、控制血壓等生理功能。但是過量外源生物胺的攝入會導致生物體的不良反應，如高血壓、頭疼，腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等。?

乳酸桿菌是是一群存在于食物和宿主體內能發酵糖類產生乳酸的細菌，被廣泛應用于多種產品的發酵生產中，如乳制品、發酵香腸、魚露、酒精飲料等。在生產過程中，原料中的天然氨基酸或者原料中的蛋白類物質可以經由酶解產生的氨基酸在微生物的氨基酸脫羧酶作用下脫羧，生成相應的生物胺。具有氨基酸脫羧酶活性的微生物包括乳酸菌以及其它生產菌與外源菌株。因此，篩選不產生物胺的乳酸桿菌對于以乳酸桿菌為主要生產菌的食品的安全生產和消費者的健康有著重要的意義。?

乳酸桿菌的抑菌作用主要是通過兩個方面實現的。一方面，由乳酸桿菌產生的乳酸，可以抑制某些細菌的生長。另一方面，多數乳酸桿菌會產生細菌素或類細菌素，起到抑制其它細菌生長的作用。乳酸桿菌合成的細菌素主要作用于革蘭氏陽性菌及與其親緣性較近的菌株，對于革蘭氏陰性菌和真菌有抑菌效果的報道較少。而在食品發酵生產過程中比較容易污染外界微生物，其中包括如大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌。這些細菌不僅會導致發酵失敗，還可能危害食用人群的健康。因此，篩選可以抑制這些革蘭氏陰性菌生長的乳酸桿菌可保證發酵食品的品質和安全。?

發明內容

本發明提供了一株抑制生物胺產生的棒狀乳桿菌（Lactobacillus?coryniformis）BBE-H3，已于2012年4月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M?2012130。?

所述棒狀乳桿菌分離自家庭自制泡菜，其保藏條件如下：從生長良好的平板上挑取單菌落轉接入MRS培養基中，在37℃靜置培養（5%CO₂）24h，取500μL培養液移入含有500μL40%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。?

所述MRS培養基為培養乳酸桿菌專用，購于OXIOD公司。?

生物胺檢測培養基：酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，NaCl?0.25%，葡萄糖?0.05%，Tween-800.1%，MgSO₄·7H₂O?0.02%，MnSO₄·H₂O?0.005%，FeSO₄0.04%，檸檬酸三胺0.2%，CaCO₃0.01%，吡哆醛-5-磷酸0.005%，K₂HPO₄0.2%，pH?5.3，溴甲酚紫0.006%，氨基酸1%。?

所述棒狀乳桿菌的培養條件為：將保藏的乳酸菌在MRS固體培養基上劃線，于37℃靜置（5%CO₂）培養48h，挑取單菌落接入MRS液體培養基，37℃靜置培養24h，離心15min（8000rpm，4℃）后去上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0）懸浮菌體。?

向96孔板中加入200μL含不同氨基酸（色氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸）的生物胺檢測培養基，分別單獨接種10μL乳酸菌。再將棒狀乳桿菌發酵液與生物胺檢測培養基按1:9、1:19的比例混合加入空白的孔中，接種10μL沙克乳桿菌。37℃靜置（5%CO₂）培養48h后，觀測到沙克乳桿菌產精胺，而加入少量棒狀乳桿菌后沙克乳桿菌不產生物胺。因此，在棒狀乳桿菌的發酵液的影響下沙克乳桿菌不產生物胺。?

本發明還提供了應用棒狀乳桿菌抑制產生物胺微生物生長的應用。?

為解決上述技術問題，將平板上活化好的棒狀乳桿菌接種于MRS液體培養基中，37℃靜置（5%CO₂）培養24h，離心15min（8000rpm，4℃）后取上清，經0.22μm濾膜過濾除菌后置于4℃冰箱保存。?

用于抑菌檢測的指示菌及其培養條件：?

大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌：LB培養基，37℃搖瓶培養；?

產堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌：LB培養基，30℃搖瓶培養；?

鼠傷寒沙門氏菌：BHI(Brain?Heart?Infusion，腦心浸液培養基)，37℃搖瓶培養；?