[發明專利]NICD基因的新應用以及一種提高真核細胞抗CVB感染能力的方法及藥物

無效

• 申請號: 201210144497.5
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN103386137A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 陳惠鵬;凌焱;孫芳;李玉霞;劉剛;張小男;湯潔;毛艷;賈天野
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P31/14;C12N5/00;C12N5/09
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.Notch蛋白胞內區基因（NICD）在制備提高真核細胞抗CVB感染能力藥物中的應用。

2.一種提高真核細胞抗CVB感染能力的藥物，其活性成分為攜帶有Notch蛋白胞內區基因（NICD）的重組DNA質粒或該重組DNA質粒轉染的真核細胞，優選上皮細胞，實驗選擇HeLa細胞。

3.根據權利要求2所述的藥物，其特征在于：所述重組DNA質粒為以pEGFP-N3為出發質粒，將所述NICD基因導入該出發質粒中得到，命名為pEGFP/NICD。

4.根據權利要求3所述的藥物，其特征在于：所述重組DNA質粒轉染的HeLa細胞為pEGFP/NICD轉染HeLa細胞得到，命名為：HeLa-pEGFP-NICD。

5.一種提高真核細胞抗CVB感染的方法，是活化Notch信號通路，使CVB病毒感染真核細胞的進程及感染量得到減弱。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述活化Notch信號通路的方法為：向真核細胞中轉染Notch蛋白胞內區基因（NICD），使Notch信號通路得到活化；具體是將所述NICD基因導入質粒中得到攜帶所述NICD基因的重組DNA質粒，再將該重組DNA質粒轉染真核細胞。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：以pEGFP-N3為出發質粒構建所述攜帶NICD基因的重組DNA質粒（命名為pEGFP/NICD）。

8.根據權利要求5或6或7所述的方法，其特征在于：所述真核細胞為CVB易感細胞，優選上皮細胞，實驗選擇HeLa細胞。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述重組DNA質粒轉染細胞的方法為：待HeLa細胞貼壁并且匯合度達到70％-80％后，轉染重組DNA質粒pEGFP/NICD。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于：以6孔板為例，所述重組DNA質粒轉染細胞的操作為：（1）每孔取4μg的重組DNA，用250μL無血清培養基進行稀釋；（2）每孔取10μL脂質體Lipofectamine^TM?2000，加入250μL無血清培養基中緩慢混勻，室溫靜置5min；（3）將步驟（1）與（2）中的溶液緩慢混勻，室溫靜置20min，得到轉染復合物；（4）將步驟（3）中的溶液加入到鋪種HeLa細胞的細胞板孔中，約500μL/孔，補加1.5mL無血清培養基至2mL/孔，輕柔晃動細胞板使轉染復合物均勻分布在培養板中，置于37℃、5％CO₂恒溫孵箱培養；（5）4-6h后將細胞板孔中的轉染復合物與無血清培養基吸出，更換為含10％FBS的DMEM培養液，37℃、5％CO₂恒溫孵箱繼續培養，一般培養24h后，熒光顯微鏡下觀察可見發綠色熒光的細胞，這些細胞就是轉染有攜帶Notch蛋白胞內區基因（NICD）的重組DNA?pEGFP/NICD的HeLa細胞，命名為HeLa-pEGFP-NICD。