[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210144243.3
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102676674A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于常海;劉樂庭;楊濱
• 申請（專利權(quán)）人: 海康生物科技（北京）有限公司;北京大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;姜義民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法。???背景技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因市場的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因生物和產(chǎn)品的環(huán)境安全和食用安全性問題引起了全球范圍內(nèi)的爭論和關(guān)注，那么轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)尤其重要，世界各國也紛紛出臺了很多的政策法規(guī)，2002年，我國農(nóng)業(yè)部頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》，要求對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，并要求檢測結(jié)果為陽性者需要標(biāo)識。而世界上的其他國家，例如歐盟、日本、澳洲、韓國也紛紛出臺相關(guān)政策，要求對超過一定含量的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識。

基于核酸的PCR檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)。根據(jù)不同的外源DNA片段，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構(gòu)建特異性PCR檢測、品系特異性PCR檢測。構(gòu)建特異性是通過檢測外源插入載體中兩個(gè)元件的連接區(qū)的DNA序列實(shí)現(xiàn)的。這種方法具有相對較高的特異性，在轉(zhuǎn)基因檢測中使用較多。

為了使得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性得到保障，在檢測過程中需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前大量使用的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)是由未加工的原材料制備而成的——基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然而，由于基質(zhì)效應(yīng)和加工過程中完整DNA分子的缺失等原因使得其作為定量標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用時(shí)具有很大局限性。同時(shí)，其制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴，且不利于長期儲存。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因檢測目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性片段的線性化重組質(zhì)粒分子。經(jīng)驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在GMO鑒定檢測中是很好的標(biāo)準(zhǔn)陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，DNA易于擴(kuò)增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高。

轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176，商品名稱為NaturGard?KnockOut玉米，是經(jīng)過特異性基因修飾而具有抗歐洲玉米螟(ECB；Ostrinia?nubilalis）抗性的玉米品系。歐洲玉米螟是一種對玉米危害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲，能殺死鱗翅目昆蟲，對家畜和人類不敏感。BT176玉米品系可以生產(chǎn)一種剪切殺蟲蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌亞種kurstaki菌株HD-1的Cry1Ab；也能表達(dá)土壤吸水鏈霉菌的bar基因，編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT）酶。目前，ISO21570、歐盟參考物質(zhì)及測量研究所對于轉(zhuǎn)基因玉米BT176的檢測均為構(gòu)建特異性檢測，因此，開發(fā)一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其制備方法，本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可用作轉(zhuǎn)基因玉米BT176構(gòu)建特異性檢測時(shí)的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是將玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列、轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列依次構(gòu)建到質(zhì)粒載體中而得；所述玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb特異性序列如SEQ?ID?No.1所示，所述轉(zhuǎn)基因玉米BT176的構(gòu)建特異性序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子中，所述質(zhì)粒載體為pEASY-T3載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述轉(zhuǎn)基因玉米BT176檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，該制備方法為：將SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列和SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列經(jīng)重疊PCR法連接起來，并將連接產(chǎn)物構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，以獲得上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。

上述制備方法中，所述SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而得。

上述制備方法中，所述SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列由SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品而得。

上述制備方法中，所述質(zhì)粒載體為pEASY-T3載體。

上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，具體步驟如下：

（1）由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列組成的引物對，擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米BT176陽性標(biāo)準(zhǔn)品，得SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；