[發明專利]一種轉基因玉米檢測用質粒標準分子及其制備方法

無效

• 申請號: 201210144243.3
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102676674A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 于常海;劉樂庭;楊濱
• 申請（專利權）人: 海康生物科技（北京）有限公司;北京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;姜義民

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種轉基因玉米檢測用質粒標準分子及其制備方法，具體涉及轉基因玉米BT176檢測用質粒標準分子及其制備方法。???背景技術

隨著轉基因市場的不斷擴大，轉基因生物和產品的環境安全和食用安全性問題引起了全球范圍內的爭論和關注，那么轉基因產品的檢測技術尤其重要，世界各國也紛紛出臺了很多的政策法規，2002年，我國農業部頒布了《農業轉基因生物標識管理辦法》，要求對轉基因成分進行檢測，并要求檢測結果為陽性者需要標識。而世界上的其他國家，例如歐盟、日本、澳洲、韓國也紛紛出臺相關政策，要求對超過一定含量的轉基因植物產品進行標識。

基于核酸的PCR檢測技術是目前應用最廣泛的轉基因植物檢測技術。根據不同的外源DNA片段，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測、品系特異性PCR檢測。構建特異性是通過檢測外源插入載體中兩個元件的連接區的DNA序列實現的。這種方法具有相對較高的特異性，在轉基因檢測中使用較多。

為了使得檢測結果的準確性得到保障，在檢測過程中需要使用標準物質。目前大量使用的標準參考物質是由未加工的原材料制備而成的——基體標準物質，然而，由于基質效應和加工過程中完整DNA分子的缺失等原因使得其作為定量標準品應用時具有很大局限性。同時，其制備復雜，價格昂貴，且不利于長期儲存。質粒標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有轉基因檢測目的外源基因和內標準基因的特異性片段的線性化重組質粒分子。經驗證質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物。質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限穩定量的標準物質，并且純度較高；且操作容易，穩定性高。

轉基因玉米品系BT176，商品名稱為NaturGard?KnockOut玉米，是經過特異性基因修飾而具有抗歐洲玉米螟(ECB；Ostrinia?nubilalis）抗性的玉米品系。歐洲玉米螟是一種對玉米危害嚴重的農業害蟲，能殺死鱗翅目昆蟲，對家畜和人類不敏感。BT176玉米品系可以生產一種剪切殺蟲蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌亞種kurstaki菌株HD-1的Cry1Ab；也能表達土壤吸水鏈霉菌的bar基因，編碼草銨膦乙酰轉移酶(PAT）酶。目前，ISO21570、歐盟參考物質及測量研究所對于轉基因玉米BT176的檢測均為構建特異性檢測，因此，開發一種轉基因玉米BT176構建特異性檢測用質粒標準分子具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉基因玉米BT176檢測用質粒標準分子及其制備方法，本發明質粒標準分子可用作轉基因玉米BT176構建特異性檢測時的陽性標準品。

為實現上述目的，本發明提供一種轉基因玉米BT176檢測用質粒標準分子，該質粒標準分子是將玉米內標準基因zSSIIb特異性序列、轉基因玉米BT176的構建特異性序列依次構建到質粒載體中而得；所述玉米內標準基因zSSIIb特異性序列如SEQ?ID?No.1所示，所述轉基因玉米BT176的構建特異性序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明質粒標準分子中，所述質粒載體為pEASY-T3載體。

本發明的另一個目的在于提供一種上述轉基因玉米BT176檢測用質粒標準分子的制備方法，該制備方法為：將SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列和SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列經重疊PCR法連接起來，并將連接產物構建到質粒載體上，以獲得上述質粒標準分子。

上述制備方法中，所述SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列組成的引物對，擴增轉基因玉米BT176陽性標準品而得。

上述制備方法中，所述SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列由SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示序列組成的引物對，擴增轉基因玉米BT176陽性標準品而得。

上述制備方法中，所述質粒載體為pEASY-T3載體。

上述質粒標準分子的制備方法，具體步驟如下：

（1）由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列組成的引物對，擴增轉基因玉米BT176陽性標準品，得SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列的擴增產物；