[發(fā)明專利]產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210143174.4
• 申請(qǐng)日: 2012-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN102643775A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜岷;劉嶸明;梁麗亞;吳明科;曹偉佳;馬江鋒;陳可泉;韋萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 樊文紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株產(chǎn)丁二酸基因工程菌及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，具體是一株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等單糖，并且高效利用各種比例混合糖以及纖維素水解液生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸重組菌株及其利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。

背景技術(shù)

丁二酸（succinic?acid）又稱琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺(tái)化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。

丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源，由于原料來源廣泛且價(jià)格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO₂，能有效緩解溫室效應(yīng)，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點(diǎn)。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Anaerobiospirillum?succiniciproducens、Actinobacillus?succinogenes、Mannheimia?succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。其中利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。而重組大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。

PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是大腸桿菌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式，但是PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的存在，使大腸桿菌不能同時(shí)利用葡萄糖和其他各種單糖代謝生長(zhǎng)，而野生型大腸桿菌能夠分別利用葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖等單糖在厭氧條件下代謝生長(zhǎng)，但是丁二酸不是其主要代謝產(chǎn)物，為減少副產(chǎn)物生成，大腸桿菌敲除或失活乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性減少副產(chǎn)物的生成。但是當(dāng)以葡萄糖或果糖為碳源時(shí)，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，導(dǎo)致菌株輔酶不平衡，并且積累了大量丙酮酸，導(dǎo)致菌體不能利用葡萄糖和果糖厭氧條件下代謝生長(zhǎng)，并生產(chǎn)丁二酸；而以木糖或阿拉伯糖為碳源時(shí)，由于敲除乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，減少了丙酮酸和乙酸的生成，從而使伴隨丙酮酸和乙酸生成的ATP減少，最終導(dǎo)致重組大腸桿菌不能利用木糖和阿拉伯糖代謝生長(zhǎng)，并生產(chǎn)丁二酸。

玉米芯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較常見的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其稀酸水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。姜岷等將玉米芯按料液比1:5(質(zhì)量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250～380μm，H₂SO₄用量3%(體積分?jǐn)?shù))，水解溫度126℃，反應(yīng)時(shí)間215h，利用活性炭吸附及Ca(OH)₂中和等方式，對(duì)玉米芯多組分糖液進(jìn)行脫毒脫鹽處理，總糖質(zhì)量濃度為50g/L，其中木糖占80%以上。

稻草秸稈是重要的一類可再生生物質(zhì)資源。目前，除了在造紙業(yè)工業(yè)方面的利用，絕大多數(shù)被廢棄，嚴(yán)重浪費(fèi)了資源并且污染了環(huán)境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，陶文沂等通過稀硫酸121℃處理稻草秸稈1h，再用20g/L的NaOH于121℃處理秸稈1h，葡萄糖和木糖二者總質(zhì)量濃度達(dá)50g/L左右。

甘蔗渣是甘蔗制糖時(shí)榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來說，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)產(chǎn)丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，約含有50%的纖維素通過粉碎以及堿/氧化法預(yù)處理可得到總糖質(zhì)量為50g/L，其中木糖占80%以上。

糖蜜是工業(yè)制糖過程中，蔗糖結(jié)晶后，剩余的不能結(jié)晶，但仍含有較多糖的液體殘留物。余煒等將糖蜜與水1:1混勻，用濃硫酸（5mol/L）將其pH調(diào)至2.0,于100℃加熱20min，并用15%的石灰乳中和處理，總糖質(zhì)量為600g/L，葡萄糖和果糖各占50%。