[發明專利]產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法

無效

• 申請號: 201210143174.4
• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN102643775A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 姜岷;劉嶸明;梁麗亞;吳明科;曹偉佳;馬江鋒;陳可泉;韋萍
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 樊文紅

1.一株產丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA305（Escherichia?coli?BA305），其保藏編號為CCTCC?NO：M2012102。

2.權利要求1所述的大腸埃希氏菌BA305的構建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發菌株，利用同源重組技術敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉移酶系統的ptsG基因后，過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶后，得到大腸埃希氏菌BA305。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于具體構建步驟如下：

（1）以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli菌株為出發菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸轉移酶系統的ptsG基因，得到同時缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受態菌株；

（2）純化擴增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，構建得到過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達質粒；

（3）將步驟（2）所述的質粒導入步驟（1）得到的感受態菌株，獲得陽性轉化子；

（4）利用步驟（3）的陽性轉化子過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢復其在厭氧條件下代謝，得到的菌株即大腸埃希氏菌BA305。

4.利用權利要求1所述的大腸埃希氏菌BA305發酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發酵產酸。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于將大腸埃希氏菌BA305按體積比1%接種量接種入有氧階段發酵培養基中有氧培養，當有氧培養菌體OD₆₀₀至0.4～0.6用0.3mM的IPTG誘導至OD₆₀₀=3時，按接種量體積比10%轉接至厭氧階段發酵培養基中厭氧發酵。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發酵培養基的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其組合。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發酵培養基的碳源為玉米芯水解液、稻草秸稈水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。