[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)人視黃醇結(jié)合蛋白4的抗體復(fù)合物及免疫層析檢測(cè)卡和試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210141597.2
• 申請(qǐng)日: 2012-05-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102650642A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢國(guó)杰;沈鶴柏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為檢測(cè)人視黃醇結(jié)合蛋白4的抗體復(fù)合物及免疫層析檢測(cè)卡。?

背景技術(shù)

視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol?Binding?Protein,RBP）是一類在人體內(nèi)負(fù)責(zé)從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇至各組織細(xì)胞的運(yùn)載蛋白，對(duì)視黃醇生理功能的發(fā)揮起著重要作用。RBP主要在肝臟中合成。肝臟中分泌的RBP-視黃醇聚合物與轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transthyretin，TTR）形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物在血液系統(tǒng)中循環(huán)。RBP-視黃醇-TTR復(fù)合體在視黃醇釋放后解體，RBP以游離形式存在于血液系統(tǒng)中，由腎小球?yàn)V過(guò)，再由近端小管上皮細(xì)胞重吸收、降解。因此正常人尿液中幾乎不含有RBP（含量低于300ng/ml）。若腎小管病變，則重吸收功能下降，會(huì)導(dǎo)致尿液中的RBP大量上升。因此，在腎小管損傷病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可達(dá)到正常人的5倍以上，嚴(yán)重者其尿液中的RBP含量甚至可以達(dá)到10000ng/ml以上。故尿液中RBP增高具有早期診斷意義，被認(rèn)為是腎小管損傷的一個(gè)良好的早期標(biāo)志物，對(duì)RBP的檢測(cè)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床上對(duì)腎臟損傷的診斷中。?

目前，醫(yī)院常用的檢測(cè)RBP的方法是基于免疫比濁法或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。但上述方法步驟比較繁瑣，測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)，結(jié)果易受操作者技術(shù)水平等的影響，不確定性因素較多。而且要求操作者具有一定的操作技能，同時(shí)配備酶標(biāo)儀，因此檢測(cè)成本相對(duì)較高。為了達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、高效和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)尿RBP的要求，我們提出開(kāi)發(fā)視黃醇結(jié)合蛋白4檢測(cè)試劑盒（膠體金免疫層析法），意在建立一種腎小管損傷診斷的新技術(shù)。另外，通過(guò)專利檢索，發(fā)現(xiàn)目前沒(méi)有通過(guò)使用膠體金免疫層析法檢測(cè)RBP4來(lái)診斷腎小管損傷的相關(guān)試劑盒專利。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物。?

本發(fā)明還提供了人視黃醇結(jié)合蛋白4的免疫層析檢測(cè)卡及試劑盒。?

一種用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物，其制備方法包括以下步驟：?

將人視黃醇蛋白4（RBP4）單克隆抗體1標(biāo)記于膠體金顆粒表面：將含有膠體金顆粒的溶液pH調(diào)節(jié)至8.2～8.7，加入人視黃醇蛋白4單克隆抗體1，震蕩反應(yīng)5～15分鐘，用BSA封閉后離心，沉淀用硼酸緩沖液重懸后再次離心純化；棄去上清取下層液體，即得到人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物。?

膠體金顆粒的粒徑為10～30nm，優(yōu)選20nm。?

人視黃醇蛋白4（RBP4）單克隆抗體1與膠體金顆粒用量比為1～8μg：1mg，優(yōu)選為5μg：1mg；膠體金顆粒溶液濃度為0.5～2mg/mL，優(yōu)選為1mg/mL。?

所得到的用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物可用于制備檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白4的試劑及試劑盒。?

所得到的用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物進(jìn)一步用來(lái)制備視黃醇結(jié)合蛋白4的免疫層析檢測(cè)卡：?

其結(jié)構(gòu)包括結(jié)合墊、樣品墊、分析膜和吸水紙，分析膜上包括檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）。?

結(jié)合墊的制備方法為：用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物與膠體金稀釋液混合（用于檢測(cè)人視黃醇蛋白4的抗體復(fù)合物與膠體金稀釋液的混合體積比為1:15～30，優(yōu)選為1:20）后噴在結(jié)合墊材料上，結(jié)合墊的材料選自玻璃纖維素膜；膠體金稀釋液為0.03～0.08mol/L、pH=7.8～8.2的Tris-HCl緩沖液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%聚乙烯基吡咯烷酮PVP，0.2%～0.5%聚乙烯醇PEG，1.0%～3.0%蔗糖，0.1%～0.3%吐溫-20；聚乙烯醇的分子量為10000～25000。?

樣品墊的制備方法為：樣品墊材料用處理液浸泡并干燥，樣品墊材料選自玻璃纖維素膜；處理液為pH=7.2～7.4、0.01～0.02mol/L的磷酸緩沖液，含0.5%～1.0%BSA，0.3%～0.8%乙烯基吡咯烷酮，0.1%～0.3%吐溫-20。?

分析膜的制備方法為：在分析膜上噴點(diǎn)RBP4單克隆抗體2和羊抗鼠IgG抗體，羊抗鼠IgG抗體在上形成質(zhì)控線（C線），RBP4單克隆抗體2在下形成檢測(cè)線（T線），烘干；分析膜的材料為硝酸纖維素膜（NC膜）。?

將上述樣品墊、結(jié)合墊、分析膜和吸水紙依次粘貼在底板上，切成4mm寬的檢測(cè)試紙條并裝在塑料外殼中，得到人視黃醇結(jié)合蛋白4的免疫層析檢測(cè)卡。?