[發明專利]一種檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210141533.2
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN102680677A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 胡衛江;歐文斌;李海龍;孟凡國;蔣哲;顧蘭蘭;馬鳳花
• 申請（專利權）人: 嘉興博泰生物科技發展有限公司;浙江清華長三角研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

技術領域

本發明涉及的是一種快速高效檢測食品中抗生素氧氟沙星殘留的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析(ELISA)技術領域，用于食品中殘留氧氟沙星含量的檢測。

背景技術

食品安全檢測作為保障食品安全的重要手段，發揮著越來越重要的作用，食品安全檢測技術的發展方向呈現兩個趨勢：一是向設備日趨完善、痕量分析方向發展；另一個是向儀器便攜化和現場檢測方向發展。食品安全檢測中備受關注的檢測物包括農獸藥殘留等項目，研發高通量、快速、靈敏的農獸藥檢測試劑可謂當務之急。

農獸藥殘留的檢測手段主要有：理化分析法、微生物法、免疫法。其中免疫學檢測是農獸藥殘留檢測的發展方向，它可以做到快速和特異性。酶聯免疫吸附方法(ELISA法)已經逐步成為食品中農獸藥殘留檢測的一種重要方法。國家獸藥安全評價中心的初步調查，國內使用ELISA試劑盒作為獸藥殘留篩選的檢測樣本數量遠遠超過微生物方法和理化分析方法。

免疫分析技術以其抗原抗體反應的高度專一性、測定方法的簡單、快速及高靈敏度、低費用和適于現場大批量樣品篩選等優點，在農獸藥殘留分析中展示了廣泛的應用前景。隨著農藥殘留免疫學檢測技術不斷被完善和商品化，免疫學檢測技術會成為食品農獸藥殘留和食品安全質量控制的有效快速檢測手段。基于目前獸藥殘留診斷試劑的研究現狀，及時開發出優于目前的、快速靈敏的檢測試劑可謂是當務之急。免疫學技術進行分析是特異性很好、檢測時間較短的方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種高效快速檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，用于食品檢測行業中氧氟沙星含量的檢測。

本發明的目的通過如下技術方案來完成的：本發明所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒，它是由微孔包被板，氧氟沙星標準品，抗氧氟沙星的抗體，氧氟沙星酶標抗原，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液所組成；所述包被板上的封閉液為1％明膠，抗氧氟沙星的抗體稀釋液為0.15mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，濃縮洗滌液為含有0.07％～0.1％吐溫的Tris-HCL緩沖溶液，顯色液A為檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯胺和二甲基亞砜、含甘油的溶液，終止液為2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗體通過合成的氧氟沙星半抗原，并將半抗原與載體蛋白(匙孔藍蛋白)通過碳化二亞胺法得到偶聯物即全抗原，以此全抗原免疫新西蘭兔，得到對氧氟沙星特異性的抗體。

所述的氧氟沙星酶標抗原是以辣根過氧化物酶(HRP)用EDC法合成酶標抗原OFL-HRP。

所述的氧氟沙星標準品是從干粉中稀釋得到，稀釋液為0.15mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，共6瓶，氧氟沙星濃度分別為：0μg/L，0.1μg/L，1.0μg/L，5μg/L，25μg/L，100μg/L。

所述抗氧氟沙星的抗體為多克隆抗體，它們均是用氧氟沙星半抗原與載體蛋白的偶聯物作為免疫原得到的；所述的氧氟沙星半抗原是將氧氟沙星和EDC法作用得到。

一種利用如上所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒進行氧氟沙星的檢測方法，該檢測方法是：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗體的微孔包被板，用洗滌液洗滌1次，加入50μl氧氟沙星標準品和處理好的樣品到各自的微孔中，同時加入50μl酶標氧氟沙星抗原，震蕩混勻，37℃孵育10分鐘左右，洗滌液洗滌三次，加50μl顯色液A和50μl顯色液B，37℃孵育15分鐘后加終止液，在450nm-630nm處測量吸光值(OD值)，對照標準曲線計算樣品中的氧氟沙星含量。

所述的檢測方法包括如下步驟：

(1)實驗前將所有試劑盒組件在室溫中平衡30分鐘；

(2)配制酶標抗原工作液和洗板工作液；

(3)取出需要數量的微孔板，每個標準品和樣本做2個平行，并記錄標準孔和樣本孔的位置；

(4)每孔加入250μl洗板工作液，輕輕震蕩下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗滌1次；

(5)每孔依次加入標準品和樣品各50μl，每孔再加入配制好的酶標抗原工作液各50μl，充分混勻1min，37℃反應30min；

(6)取出反應板，每孔加入250μl洗板工作液，輕輕震蕩下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗滌3次；

(7)每孔加入顯色液A液和B液各50μl，避光37℃顯色15min；

(8)每孔加入終止液各50μl，用酶標儀在波長450nm/630nm處讀取吸光度值；