[發明專利]一種檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210141533.2
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN102680677A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 胡衛江;歐文斌;李海龍;孟凡國;蔣哲;顧蘭蘭;馬鳳花
• 申請（專利權）人: 嘉興博泰生物科技發展有限公司;浙江清華長三角研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒，其特征在于它是由帶微孔包被板，氧氟沙星標準品，抗氧氟沙星的抗體，氧氟沙星酶標抗原，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液所組成；所述包被板上的封閉液為1％明膠，抗氧氟沙星的抗體稀釋液為0.15mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，濃縮洗滌液為含有0.07％～0.1％吐溫的Tris-HCL緩沖溶液，顯色液A為檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖溶液，顯色液B為四甲基聯苯胺和二甲基亞砜、含甘油的溶液，終止液為2mol/L的硫酸溶液；所述的抗氧氟沙星的抗體是通過先合成氧氟沙星半抗原，在將氧氟沙星半抗原與載體蛋白通過碳化二亞胺法得到的偶聯物即全抗原，以此全抗原免疫新西蘭兔，得到對氧氟沙星特異性的抗體。

2.根據權利要求1所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒，其特征在于其中的氧氟沙星酶標抗原是以辣根過氧化物酶用EDC法合成酶標抗原OFL-HRP，并利用紫外分光光度計進行鑒定。

3.根據權利要求1所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒，其特征在于其中的氧氟沙星標準品是從干粉中稀釋得到，稀釋液為0.15mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，共6瓶，氧氟沙星濃度分別為：0ug/L，0.1ug/L，1.0ug/L，5ug/L，25ug/L，100ug/L。

4.根據權利要求1所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒，其特征在于其中的抗氧氟沙星的抗體為多克隆抗體，它們均是用氧氟沙星半抗原與載體蛋白的偶聯物作為免疫原得到的；所述的氧氟沙星半抗原是將氧氟沙星和EDC法作用得到；所述的載體蛋白為匙孔藍蛋白。

5.一種利用如權利要求1或2或3或4所述的檢測氧氟沙星的酶聯免疫試劑盒進行氧氟沙星的檢測方法，其特征在于：取包被抗氧氟沙星-KLH抗體的微孔包被板，加入氧氟沙星標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入酶標的氧氟沙星抗原，震蕩反應，洗滌液洗滌，加顯色液A和顯色液B，避光放置后加終止液，在450nm-630nm處測量吸光值，對照標準曲線計算樣品中的氧氟沙星含量。

6.根據權利要求5所述的氧氟沙星的檢測方法，其特征在于：取包被有抗氧氟沙星-KLH抗體的微孔包被板，用洗滌液洗滌1次，加入100ul氧氟沙星標準品和處理好的樣品到各自的微孔中，同時加入50ul酶標氧氟沙星抗原，震蕩混勻，37℃孵育10分鐘左右，洗滌液洗滌三次，加50ul顯色液A和50ul顯色液B，37℃孵育15分鐘后加終止液，在450nm-630nm處測量吸光值，對照標準曲線計算樣品中的氧氟沙星含量。

7.根據權利要求5所述的氧氟沙星的檢測方法，其特征在于所述的檢測方法包括如?下步驟：

(1)實驗前將所有試劑盒組件在室溫中平衡30分鐘；

(2)配制酶標抗原工作液和洗板工作液；

(3)取出需要數量的微孔板，每個標準品和樣本做2個平行，并記錄標準孔和樣本孔的位置；

(4)每孔加入250μl洗板工作液，輕輕震蕩下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗滌1次；

(5)每孔依次加入標準品和樣品各50μl，每孔再加入配制好的酶標抗原工作液各50μl，充分混勻1min，37℃反應30min；

(6)取出反應板，每孔加入250μl洗板工作液，輕輕震蕩下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗滌3次；

(7)每孔加入顯色液A液和B液各50uL，避光37℃顯色15min；

(8)每孔加入終止液各50uL，用酶標儀在波長450nm/630nm處讀取吸光度值。

8.根據權利要求6或7所述的氧氟沙星的檢測方法，其特征在于：處理好的樣品是根據前處理方法確定，具體是：用勻漿機攪勻樣本，取1g勻質樣本，加入處理液2mL，充分混勻10min，用離心機5000rpm離心15min，取上層液，用PBS稀釋2倍左右后可以進行測定，且本前處理的方法可以用于豬肉、豬肝、蝦、魚、甲魚、雞肉中氧氟沙星的檢測。?