[發(fā)明專利]檢測家蠅對殺蟲劑靶標(biāo)抗性的方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210140577.3
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN103388022A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱星輝;潘婧;李梅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院動物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及家蠅鈉離子通道殺蟲劑抗性基因型的分子檢測技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，適合用于家蠅對DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的快速檢測。

背景技術(shù)

家蠅（Musca?domestica）是一種重要的疾病傳媒，可以傳播100多種人畜疾病，包括一些抗生素耐藥致病菌。同時，家蠅也是重要的畜牧業(yè)害蟲，家蠅的侵?jǐn)_導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的降低。因此家蠅種群的控制對于人類的健康和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長期以來主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，抗藥性問題突出。抗藥性導(dǎo)致殺蟲劑殺蟲效率的下降，由此引發(fā)諸如殺蟲劑使用次數(shù)和劑量增加，蟲媒人畜疾病的流行等問題己給人類帶來巨大損失。

DDT農(nóng)藥和擬除蟲菊酯殺蟲劑（如溴氰菊酯）已廣泛用于家蠅的防治，許多報(bào)告表明，我國家蠅種群對這些殺蟲劑普遍產(chǎn)生了抗性。家蠅抗藥性的治理以及抗藥性的檢測是科學(xué)制定有效的防治措施的前提，對減少化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導(dǎo)意義。

以往，家蠅對擬除蟲菊酯類的抗性的檢測常采用生物測定，這種方法存在如下缺點(diǎn)：（1）試驗(yàn)周期長：一般需要24小時以上才能得到生測結(jié)果；（2）對試蟲的數(shù)量和質(zhì)量要求高：為保證生測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要使用特定生理狀態(tài)的試蟲；（3）難于檢測早期抗性和預(yù)測抗性的發(fā)展趨勢：生物測定的方法只能記錄殺蟲劑劑量和試蟲死亡率的信息，而無法測定個體的基因型。這些缺點(diǎn)給家蠅抗性的監(jiān)測帶來了很大的困難。

近年來，隨著對家蠅抗藥性抗性分子機(jī)制的了解以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)儀器設(shè)備的普及，國內(nèi)外開始建立和推廣家蠅抗藥性的分子檢測技術(shù)。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，家蠅對擬除蟲菊酯類及DDT抗性的主要機(jī)制之一是鈉離子通道基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致家蠅對農(nóng)藥的敏感性下降（即靶標(biāo)不敏感性）。

當(dāng)前通過分子生物學(xué)機(jī)制檢測家蠅抗藥性的方法主要為檢測家蠅鈉離子通道蛋白在1014位點(diǎn)的氨基酸變異（參見參考文獻(xiàn)1-9），具體地，檢測在此位點(diǎn)上亮氨酸（L）變?yōu)楸奖彼幔‵）的變異（稱為kdr）。在我國，家蠅鈉離子通道蛋白在1014位點(diǎn)的氨基酸變異還包括由亮氨酸（L）變?yōu)榻M氨酸（H）（稱為kdr-his）。在我國，L1014H變異比1014F抗性突變的頻率更高、分布更廣（參見參考文獻(xiàn)10）。單獨(dú)對此位點(diǎn)上亮氨酸（L）變?yōu)楸奖彼幔‵）的變異（稱為kdr）進(jìn)行檢測時，無法對家蠅種群的抗藥性進(jìn)行準(zhǔn)確的評價(jià)，從而選擇合適的殺蟲方案。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)我們對我國各地家蠅抗藥性機(jī)制的研究結(jié)果，提出了家蠅抗藥性的分子檢測方法，包括L1014F和L1014H這兩個抗性相關(guān)基因突變的檢測方法。同時本發(fā)明還提供了用于檢測家蠅抗藥性的試劑盒。

在本發(fā)明的一個方面，公開了一種檢測家蠅對殺蟲劑靶標(biāo)抗性的方法，所述殺蟲劑為DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑，其特征在于所述的方法包含步驟：（1）提取單頭家蠅基因組DNA；（2）檢測家蠅鈉離子通道基因1014位上的L1014F突變和L1014H突變。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，所述的家蠅鈉離子通道基因的序列選自SEQ?ID?NO:５（鈉離子通道基因1014L）、SEQ?ID?NO:6（鈉離子通道基因1014F）和SEQ?ID?NO:7（鈉離子通道基因1014H）。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，所述的分子檢測是通過PCR方法進(jìn)行的；優(yōu)選地，所述的PCR使用下列引物：

P1：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ?ID?NO:1）、

P2：GAAGCCTCCATCCTGGGAG（SEQ?ID?NO:2）、

P3：AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ?ID?NO:3）、以及

P4：CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ?ID?NO:4）。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，上述方法還包括步驟：將PCR產(chǎn)物使用DNA限制性內(nèi)切酶Tsp509I或Nla?III進(jìn)行切割，并對切割后的核酸片段進(jìn)行檢測。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，檢測家蠅鈉離子通道基因1014位的表型包括執(zhí)行以下的步驟：a）使用引物P1和P2對家蠅基因組DNA進(jìn)行PCR；

b）使用引物P3和P4對家蠅基因組DNA進(jìn)行PCR；c）使用DNA限制性內(nèi)切酶Tsp509Ｉ將步驟a）得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；d）使用DNA限制性內(nèi)切酶Nla?III將步驟b）得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；以及e）將步驟c）和d）步驟中得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；優(yōu)選地，所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳。