[發明專利]梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒及其制備

無效

• 申請號: 201210140565.0
• 申請日: 2012-05-08
• 公開（公告）號: CN102634599A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 劉莉莉;林麗蓉;張長弓;童曼莉;徐竟波;楊天賜
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶和質控品瓶設在包裝盒內；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標準品瓶設有6個含tmpA基因的標準品質粒瓶；所述質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。

2.如權利要求1所述的梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述耐熱DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶；

所述6個含tmpA基因的標準品質粒的濃度可分別為1.0×10²copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁶copies/mL和1.0×10⁷copies/mL，共6個濃度。

3.如權利要求1所述的梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應液的成份含有PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs和tmpA基因引物、探針組成的混合物；

所述耐熱DNA聚合酶具有3′→5′DNA聚合酶活性、5′→3′DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。

4.如權利要求1所述的梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）靶基因篩選，具體方法如下：

從基因庫中篩選梅毒螺旋體tmpA基因，tmpA基因探針和引物的設計采用PCR引物探針設計軟件輔助完成，然后通過Basic?Local?Alignment?Search?Tool進行同源性比對以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定后，保存，所述TE為10mM?Tri-HCl，pH5.0，0.1mM?TA；

2）tmpA基因標準品質粒的構建，具體方法如下：

以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟1）中的tmpA基因的引物，進行PCR擴增，具體過程如下：將擴增產物經過回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5μL等量的Solution?I，16℃反應30min，與pMD18-T載體連接將連接產物轉化至DH5α中，冰中放置30min，42℃加熱45s后，再在冰中放置1min，加入LB培養基，37℃震蕩培養60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒并對其進行PCR，Xab?Ⅰ和Sal?Ⅰ雙酶切及測序鑒定后，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計定量并-20℃保存作為FQ-PCR的標準品；

3）tmpA基因檢測試劑標準曲線制作，其具體方法如下：

包含tmpA基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp?LB肉湯增菌，提取質粒，取10μL質粒用雙蒸水稀釋100倍，260nm，280nm比色，純度=A₂₆₀/A₂₈₀，濃度=A₂₆₀×50×2×100×10^-6×6.02×10²³/(2806×324.5×2)copies/mL，根據質粒濃度，進行梯度稀釋，以每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應，確定線性范圍；

4）制備PCR反應液，其具體方法如下：

采用PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs、tmpA基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應液；

5）制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下：

大腸桿菌用異丙基硫代-β-D半乳糖苷進行誘導表達，誘導后的菌懸液100ml經5000r/min，4℃離心5min，以10ml緩沖液I重懸菌液，4℃，5000r/min，離心5min，細菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶使濃度達5mg/ml，37℃水浴20min；加入5ml緩沖液Ⅱ，75℃水浴45min，4℃，15000r/min離心10min；上清加入硫酸銨使達30%，4℃，1500r/min離心10min，沉淀溶于1ml緩沖液Ⅲ中，并對緩沖液Ⅲ在4℃條件下透析，每6h換液1次共4次，離心除去不溶物后，-20℃凍存；

6）建立樣品處理方法，其具體方法如下：

使用梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA；

7）制備質控品，其具體方法如下：

制備陰性質控品：選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本；

制備陽性質控品：選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品；

8）制備梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體tmpA基因FQ-PCR檢測試劑盒。