[發明專利]一種菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用

無效

• 申請號: 201210140532.6
• 申請日: 2012-05-09
• 公開（公告）號: CN102786594A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 余伯陽;許玉;劉吉華
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K16/16
• 分類號: C07K16/16;C07K14/765;G01N33/577
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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用。?

背景技術

菝葜皂苷元(sarsasapogenin)是中藥知母主要活性成分甾體皂苷的主要甾體母核，是知母等中藥的主要有效成分之一，廣泛用于煩熱消渴，熱性病高燒，肺熱咳嗽，結核病發熱，糖尿病，大便干燥等的治療，能增強老年動物大腦膽堿能系統功能，改善腦內自由基代謝，提高學習記憶能力，老年性癡呆癥及腦功能減退等癥狀，因此菝葜皂苷元具有廣泛的應用前景。菝葜皂苷元結構上不具有共軛的多烯或π鍵體系，使得其光譜吸收只有弱的紫外末端吸收，分析困難，現有的分析方法如TLC，HPLC-ELSD法和LC-MS，其中薄層色譜法雖然要求不高，但是檢測的靈敏度太低，高效液相色譜法，質譜法雖然靈敏度高，能進行大規模檢測，但是其檢測時間長，分析樣品制備復雜，且由于菝葜皂苷元沒有紫外吸收、質譜響應低，難以進行藥物代謝研究的生物樣品中菝葜皂苷元的痕量檢測。酶聯免疫法(ELISA)具有靈敏度，操作簡單，成本低，檢測速度快等特點，之前已有專利敘述了以多抗為基礎的酶聯免疫法來檢測菝葜皂苷元，相比多抗來說，單克隆抗體單純針對某一抗原上的某一抗原決定簇的抗體，相對特異性更高，靈敏度高并且可大量制備，所以建立以單克隆抗體的酶聯免疫法不僅靈敏度高，操作簡單，成本低而且特異強，穩定性高，并且來源簡單，能快速檢測知母藥材中菝葜皂苷元將有十分廣泛的應用前景。為了制備檢測試劑盒，得到菝葜皂苷元細胞株，及針對菝葜皂苷元的單克隆抗體是關鍵。?

發明內容

本發明的目的是獲得一種特異性識別菝葜皂苷元單克隆抗體，單克隆抗體的產生過程，由骨髓瘤細胞與產生抗菝葜皂苷元的脾細胞融合制備而成的雜交瘤分泌得到的。?

所述的脾細胞得自以菝葜皂苷元衍生物與牛血清白蛋白偶聯物(SAR-HS-BSA)免疫的動物?

所述的偶聯物制備過程：將菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)9.8mg、NHS?13mg、?DCC19mg混合于1mLDMF中，置磁力攪拌器上室溫攪拌反應4小時后加30mg?BSA溶液，4℃攪拌反應過夜后將產物裝入透析袋中，雙蒸水透析72小時，凍干得白色粉末，-20℃保存。同方法制備包被原——菝葜皂苷元衍生物與雞卵清白蛋白(21mg)偶聯物(SAR-HS-OVA)。?

所述的融合制備過程：采用SAR-HS-BSA免疫Balb/c小鼠后，將抗血清效價高特異性強的Balb/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞按5∶1的比例混合，45秒內加入聚乙二醇，然后加入DMEM培養基水浴中靜置10min，離心，棄去上清，細胞加入含有HAT的DMEM培養液，混合均勻后每孔100μl滴加到96孔板內，培養于CO₂濃度為5％和37℃恒溫箱中。?

所述的篩選陽性雜交瘤細胞過程如下：用SAR-HS-OVA包被酶標板，用酶聯免疫間接法對細胞上清液進行鑒定；將陽性值大于陰性值2倍，且陽性值大于0.5以上的細胞孔內細胞及時進行克隆。?

6.本發明的又一目的是利用菝葜皂苷元單克隆抗體檢測知母和大鼠血清中菝葜皂苷元的含量?

本發明提供的菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用，具有如下優點：?

1.利用本發明提供的單克隆抗體對菝葜皂苷元的IC₅₀為330.79ng/mL，靈敏度較高。?

2.利用本發明提供的單克隆抗體的特異性強，僅與魯斯可皂苷元，薯蕷皂苷元，短亨山麥冬皂苷C的交叉反應分別為33％，5.7％，29％，而與三七皂苷R1，甘草酸二銨，齊墩果酸無交叉反應。?

3.利用本發明提供的單克隆抗體建立了酶聯免疫吸附法(ELISA)，線性范圍為5ng/ml-5μg/ml，檢測不同產地知母藥材中菝葜皂苷元的含量，與HPLC法結果相關性良好；且ELISA分析方法較HPLC法具有快速、微量檢測的特點，可用于藥物代謝等研究中的痕量檢測。?

綜上所述，本發明提供的單克隆具有靈敏度高，特異性強的特性。本發明成功制備了單克隆抗體，為菝葜皂苷元在知母提取物中和血漿中的快速檢測提供了關鍵技術。?

附圖說明

圖1為免疫原(SAR-HS-BSA)的紅外光譜圖?

圖2為及包被原(SAR-HS-OVA)的紅外光譜圖?

圖3為單克隆抗體亞型結構圖?

圖4為SAR抗體的競爭抑制曲線測定?

圖5為SAR抗體檢測血漿中SAR濃度隨時間變化的曲線?

具體實施方式