[發明專利]一種阿拉伯糖誘導的表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210139353.0
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102676509A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 溫廷益;張蕓;商秀玲;來書娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N1/21;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種阿拉伯糖誘導的表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

谷氨酸棒桿菌屬于高GC含量的革蘭氏陽性菌，具有較強的氨基酸和有機酸的合成能力，可以生產多種化學物質，是一種重要的工業微生物。通過基因工程改造的方法調節谷氨酸棒桿菌胞內的代謝網絡或者通過代謝工程方法為谷氨酸棒桿菌構建新的代謝途徑，可以獲得具有高生產強度菌株，其可以生產各種生物物質，如泛酸，木糖醇，海藻糖和聚羥基丁酸脂等。基因工程或代謝工程的基本方法是在加強表達途徑中的關鍵酶基因或者誘導表達新的代謝途徑基因。這些基因都是在啟動子的調控下表達，其表達強度和調控嚴謹性依賴于啟動子的元件。到目前為止，乳糖誘導表達的啟動子及其衍生啟動子被廣泛應用于谷氨酸棒桿菌。這些啟動子在誘導物存在的條件下可以迅速激活啟動子的轉錄，然而它們在谷氨酸棒桿菌中的表達強度低于其在大腸桿菌中的表達強度，而且還有較高水平的本底表達，不能夠提供嚴緊性的調節。研究人員已經通過突變P_tａｃ啟動子-10區的核甘酸序列和利用強組成型表達的啟動子調節阻遏蛋白的表達的方法，來提高啟動子的P_ｔａｃ表達水平和調節的嚴緊性（Journal?of?Microbiologly?Methods,2010，80，86-92；Plasmid，2010，2，85-91）。但是，由于谷氨酸棒桿菌對誘導劑的滲透能力較低，使得這些啟動子的表達水平仍然相對較低。作為誘導劑的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）由于價格較高而且對細胞有潛在的毒性，使其不能夠被廣泛的應用于工業大規模的蛋白表達或者生物材料的生產。盡管谷氨酸棒桿菌中許多的啟動子的調節機制被廣泛研究（Journal?of?Biotechnology，2003，104，287-99；Journal?of?Biotechnology，2011，90，1641-1654），到目前為止，在谷氨酸棒桿菌中仍缺乏一種可以嚴謹性調節，高效表達，而且滿足工業生產需要的表達載體。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種DNA片段。

本發明提供的DNA片段，依次包括谷氨酸棒桿菌的組成型啟動子P_hom、阿拉伯糖轉運蛋白基因araE、調控蛋白基因araC、調控蛋白基因啟動子P_c、阿拉伯糖啟動子P_BAD。

上述的DNA片段中，所述谷氨酸棒桿菌的組成型啟動子P_hom為序列表中序列1自5’末端第5239-5369位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述阿拉伯糖轉運蛋白基因araE為序列表中序列1自5’末端第5382-6800位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述調控蛋白基因araC為序列表中序列1自5’末端第6821-7699位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述調控蛋白基因啟動子P_c為序列表中序列1自5’末端第7850-7878位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述阿拉伯糖啟動子P_BAD為序列表中序列1自5’末端第7975-8002位核苷酸所示的雙鏈DNA片段。

上述的DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列1自5’末端第5239-8046位。

本發明的另一個目的是提供一種表達載體。

本發明提供的表達載體，為環狀雙鏈DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大腸桿菌ori?pUC、谷氨酸棒桿菌的復制起點ori?pBL1、氯霉素抗性基因cat、權利要求1或2所述的DNA片段和轉錄終止子rrnB。

上述表達載體具體為自5’末端至3’末端依次包括大腸桿菌oripUC、谷氨酸棒桿菌的復制起點ori?pBL1、氯霉素抗性基因cat、谷氨酸棒桿菌的組成型啟動子P_hom、阿拉伯糖轉運蛋白基因araE、調控蛋白基因araC、調控蛋白基因啟動子P_c、阿拉伯糖啟動子P_BAD和轉錄終止子rrnB。

上述的表達載體中，所述大腸桿菌ori?pUC的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第967-1539位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述谷氨酸棒桿菌的復制起點ori?pBL1為序列表中序列1自5’末端第1724-4278位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；