[發明專利]一種用于檢測PDGFRα基因突變的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201210138711.6
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102719530A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 張海龍;阮力;羅捷敏;周細武;鄭立謀
• 申請（專利權）人: 廈門艾德生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

血小板衍生生長因子受體（Platelet-derived?Growth?Factor?Receptors,PDGFR）是一種調節細胞生長的跨膜蛋白,屬于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌細胞，內皮組織細胞、成纖維細胞和膠質細胞。PDGFR由α和β兩種亞型結構組成，分子量約為170-180kD,可以分為配體結合區，跨膜區、近膜區和酪氨酸激酶區四個結構功能區（Bauman?et?al.,Clin?Cancer?Res?2007,13;4632）。PDGFR在調節細胞增殖，分化和新血管形成等方面發揮重要調節作用。PDGFR通過與信號分子結合后形成受體配體復合物并活化PDGFR，進而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信號通路，通過各種信號轉導通路將有絲分裂等信號傳遞入細胞核，誘導相應基因表達，進而調節腫瘤細胞的分裂和增殖(Kim?et?al.,J?Biochem?Mol?Biol,2003,3649-59)。?

Gleevec（格列衛）和Sutent（索坦）是針對PDGFR?α靶點開發一類小分子腫瘤靶向藥物，通過抑制PDGFR?α激酶的磷酸化及其相關通路，從而阻斷下游信號的傳導，達到抑制腫瘤生長的目的。目前，Gleevec是胃腸道間質瘤(Gastrointestinal?stromal?tumor)和黑色素瘤（Melanoma）患者的一線治療藥物，然而，Gleevec治療會易引起腫瘤化療的耐藥性。臨床研究顯示，PDGFR?α的D842V突變是導致胃腸道間質瘤和黑色素瘤患者對Gleevec化療原發耐藥的主要原因(Heinrich,Corless?et?al.2003J?Clin?Oncol.21，4342-4349)。在含有PDGFRαD842V突變患者中，其Gleevec或Sutent化療的客觀有效率和緩解率顯著低于PDGFRαD842V非突變患者。因此，檢測腫瘤患者的PDGFR?α基因D842V的突變情況可以有效用于Gleevec和Sutent化療的預后。在實施化療之前，通過高靈敏的方法對PDGFR?α基因突變檢測對于延長腫瘤患者生存期，提高治療效果和生存質量，避免過度化療，指導臨床科學用藥有重要意義。?

目前檢測PDGFRα基因突變的檢測方法主要為DNA直接測序法。然而，直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30%；實驗操作復雜，檢測效率低、樣品易污染、通常要1-2天才可出檢測結果。特別是對于小樣本的檢測，直接測序的方法幾乎無法實現其準確檢測，會導致大量漏檢及假陰性的發生。包括PDGFRα基因在內的基因突變屬體細胞稀有突變，具有稀少性、異質性、不穩定性的特點，而且臨床檢測樣本多數為小樣本檢測。因此，直接測序等技術無法滿足臨床檢測的實際需求，臨床迫切需要開發一種高靈敏度，快速的PDGFRα基因突變檢測技術，以實現采用高靈敏度檢測方法對PDGFRα基因驅動突變進行?檢測，從而為臨床腫瘤的個體化治療方案提供科學參考。?

本發明開發一種快速，高靈敏、操作簡便的PDGFRα基因突變檢測試劑盒及檢測方法。該檢測方法靈敏度高，檢測時間只需90分鐘即可完成，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優點。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測PDGGFRα基因突變的特異引物和探針，或與其有同一性核苷酸序列，該檢測試劑盒包含以下引物及探針序列：?

表1引物與探針核苷酸序列?

此處所述的“同一性核苷酸序列”表示在嚴格條件下（最大嚴緊性條件下）與靶雜交的寡核苷酸，以及在具有適當的核苷酸插入或缺失情況下進行對比時，在核苷酸的至少約60%的核苷酸相同于上述核苷酸片段。更佳地，為具有80%同一性的核苷酸，最佳地，為具有90%同一性的核苷酸。?

雜交條件根據雜交時所用條件的嚴緊性程度來分，嚴緊性程度可以核酸結合復合物或探針的的解鏈溫度（Tm）為依據。例如，“最大嚴緊性”為Tm-5℃（低于探針Tm?5℃）；“高等嚴緊性”發生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴緊性”發生在Tm以下約10-20℃；低嚴緊性發生在Tm以下約20-25℃。?

在本發明中，“同一性”指，兩種或以上的序列或亞序列進行比較時，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基。用于確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是根據BLAST或BLAST2.0算法，它們分別在以下文獻中公開：Altschul等（1977）Nucl.Acid.res.25:3389-3402和Altschul等（1990）J.Mol.Biol.215:403-410.?