[發明專利]蛇毒神經生長因子活性多肽的篩選方法

無效

• 申請號: 201210138546.4
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102816766A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 徐軍;吳鵬;祁榮;張忠
• 申請（專利權）人: 沈陽醫學院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C07K14/48
• 代理公司: 廣州天河互易知識產權代理事務所(普通合伙) 44294
• 代理人: 鮑子玉

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及蛇毒神經生長因子活性多肽的篩選方法。

背景技術

神經生長因子（Nerve?Growth?Factor，NGF）具有廣泛的臨床應用前景，主要表現在：促進神經元的發育和分化，減輕病理狀態下神經元損傷，促進神經元修復和再生；誘導血管內皮細胞，促進血管生成；提高細胞溶酶體內各種水解酶活性，增強巨噬細胞吞噬能力，及誘導細胞凋亡等。蛇毒神經生長因子（Venom?NGF，vNGF）與人類NGF的同源性在66％-80％之間，對人類神經細胞具有可靠的正向調節作用，作用機制相通，存在相似的多肽刺激和激活領域。目前，國內外已對vNGF進行了大量的基礎性研究，但有關臨床應用的研究和實踐甚少，主要受限于以下原因：由于NGF促進生長和誘導細胞凋亡的雙重功效，療效尚不十分確切；vNGF原料不易獲取，純化過程繁雜；進入體內后，活性維持和作用效果不詳。故而，迄今為止，vNGF尚未能在臨床上得到較好的應用。

目前，在已知的神經生長因子β鏈118個氨基酸序列中，以小鼠NGF的cDNA為探針，已從人的DNA文庫中克隆出人類NGF的基因編碼鼠、人類、牛、雞胚和蛇的NGF?cDNA已經被測序和克隆。因為蛇毒中NGF含量最豐富，同時蛇類NGF與人類的同源性在66％-80％之間，但對人類神經細胞依然具有可靠的正向調節作用，作用機制相通，存在相似的多肽刺激和激活領域，因此備受人們關注。vNGF的代表株是一種活化的重組蛇毒神經生長因子——sputa?NGF，被證明在體內外均是無毒的，更具安全性。對比11株已登錄的vNGF的mRNA序列，我們發現vNGF具有高度的同源性，介于93％-99％，其變異點主要集中在441位點、541位點和555位點。Kostiza等根據亞基數目以及亞基之間的結合方式將蛇毒分為四類，并指出β-亞基是NGF的活性部位。NGF生物活性的發揮是通過受體介導的，NGF受體有兩類：TrKA和P75，分別以高、低親和力結合NGF。TrkA受體屬于酪氨酸激酶家族，與NGF結合后，可激活Ras、Akt等多條信息途徑，調節神經細胞的存活、生長和分化。P75受體的效應主要是誘導細胞凋亡。

本研究以sputa?NGF為模板，通過基因重組構建2個組蛋白標記的融合蛋白質作為研究模型的不同多肽刺激物；通過不同長度的功能多肽片段刺激研究模型細胞——雞胚背根神經節組織和大鼠腎上腺嗜鉻細胞(pheochromocy?toma?cells，PC12)，解析其兩個不同受體TrKA和P75的活化狀態，及細胞內信號轉導的信息表達水平和磷酸化水平，利用特異性細胞信號分子活化抑制劑阻斷細胞內特定分子的信號轉導，綜合判斷vNGF的功能區域，從而鑒定vNGF的具有活性的多肽組成和序列，為具有單一取向的蛇毒神經生長因子活性多肽的新藥生產提供分子生物學數據和奠定理論基礎。

發明內容

為解決現有技術存在的問題，本發明目的是提供一種利用基因重組技術分段篩選蛇毒神經生長因子活性多肽的方法。

本發明所述蛇毒神經生長因子活性多肽的篩選方法，其包括以下步驟：

一、融合蛋白質的構建：選擇活化的重組蛇毒神經生長因子，以sputa?NGF(vNGF)為模板，進行功能區域斷點分析，然后通過PCR引物法構建至少兩個不同長度的片段序列，并作標記。

二、質粒表達系統的構建：將上述片段序列分別組裝在pBluscriptII?SK+質粒中，構建vNGF的轉移載體，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽質粒轉移系統，然后利用單一酶切點的黏性末端連接方法將具有相同黏性末端的至少兩個不同長度的基因片段和目的片段連接，分別組裝在pQE30質粒的BamHI和HindIII酶切位點之間，克隆并表達vNGF的活性多肽。

三、通過6X組氨酸回收提純技術進行分離、鑒定、提純，形成vNGF活性多肽的刺激物原液。

四、驗證原核表達vNGFβ片段的生物活性，進行多肽篩選。

所述片段序列為2個，分別為：vNGF?F1片段，對應20-388基因位點，計369bp；vNGF?F2片段，對應389-751基因位點，計363bp。

所述驗證原核表達vNGF片段的生物活性的方法為：大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤培養檢測法。

本發明所述蛇毒神經生長因子活性多肽的篩選方法，其有益效果是：