[發明專利]一種人用預防狂犬病和破傷風的疫苗

有效

• 申請號: 201210137897.3
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102671194A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 蔡勇;侯文禮;鐘澤榮;馮曉
• 申請（專利權）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/205;A61K39/08;A61P31/04;A61P31/14;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 成都華典專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 徐豐;楊保剛

技術領域

本發明屬于疫苗領域，具體涉及一種人用預防狂犬病和破傷風的疫苗。

背景技術

狂犬病即瘋狗癥，又名恐水癥，是一種侵害中樞神經系統的急性病毒性傳染病，所有溫血動物包括人類，都可能被感染。它多由染病的動物咬人而得。由于狂犬病尚無有效的治療手段，發病死亡率極高，因此，疫苗的預防接種是防止狂犬病發生、保證人民健康的唯一有效手段。

人二倍體細胞（Human?Diploid?Cell，HDC）狂犬病疫苗是將狂犬病病毒固定毒株在人二倍體細胞上適應、傳代增殖、濃縮、純化而來。因為所用細胞來源于人類，具有副反應小、免疫起效時間短、抗體滴度高等優點，尤其對狂犬病這種高致死性疾病，能夠使個體盡快獲得保護性抗體是至關重要的。

HDCV的缺點在于HDC不太容易培養，而且狂犬病毒在HDC上培養的病毒滴度相對較低，僅能在空間有限的細胞瓶內培養，這使得疫苗的價格比較昂貴。在美國，用HDCV暴露后處理一個療程費用高達一千多美元，這樣就限制了該疫苗在發展中國家的使用。由于狂犬病疫苗的特殊性和復雜性，制備該疫苗具有相當的難度，特別是在分離和純化方面。

另外，在狂犬咬傷后通常需要注射大量的破傷風抗毒素，用于預防破傷風梭狀芽孢桿菌的感染，這就造成用藥的不便。

發明內容

本發明的目的是提供一種能同時預防狂犬病和破傷風的疫苗。

本發明的技術方案為：一種人用預防狂犬病和破傷風的疫苗，其由狂犬疫苗和破傷風類毒素組成，所述狂犬疫苗由人用二倍體細胞WI-38接種CDKHBP-1毒株純化得到。

進一步地，所述破傷風類毒素的量為5～9LF/劑。

進一步地，破傷風類毒素可采用任何現有工藝制備，所述狂犬疫苗由以下方法制得：

1)?人二倍體細胞WI-38的復蘇、培養及擴增；

2)?在人二倍體細胞WI-38上接種CDKHBP-1毒株；

3)?收獲病毒液，滅活、濃縮；

4)?純化；

進一步地?，所述純化包括以下步驟：

1）超濾純化；

2）蔗糖密度區帶離心；

3）Sepharose4FF柱層析純化；

4）加入納米氫氧化鋁佐劑吸附，加保護劑人血白蛋白。

本工藝使用的人二倍體細胞種來源于中國疾病預防控制中心，先建立人二倍體細胞種子庫和工作庫，并對細胞庫細胞進行系統的鑒定，在制備疫苗前，先進行細胞的復蘇、培養和擴增，以達到生產批量的需要。可使用動物細胞培養液加入牛血清配制而成的細胞培養液，所述的培養液可以選擇199培養液、平衡鹽培養液，其中優選199培養液，細胞培養液中含2～10%的牛血清和卡那霉素或慶大霉素26～30U/ml，pH7.0～7.5，其培養溫度為35～37℃，培養方式為轉瓶培養、細胞工廠培養或微載體反應器培養。

培養過程中，細胞分種率根據生產批量的需要確定，一般可以是1:2～1:4當細胞長成致密單層后，即可接種狂犬病病毒，細胞維持液中最好加入0.3～0.5%（W/W）的人血白蛋白，同時調整pH7.0～7.5，培養溫度35～37℃，并可加入抗生素適量，可使用的培養液包括199液、平衡鹽液等，接種過程包括先用培養液如Earle氏液等沖洗細胞表面，去除殘留的牛血清，然后在已生長致密單層的人二倍體細胞上接種狂犬病毒毒株CDKHBP-1毒株0.1～0.01mol及上述細胞維持液，培養66～79小時，即可收獲病毒液。

狂犬病毒在人二倍體細胞上的生長繁殖可維持較長時間，病毒的收獲可采取多次收取的方式，最好是3～5天收獲一次，要求每批所收獲病毒液病毒滴度均應不低于8.0LgLD50/ml。

本工藝在人二倍體細胞上接種的狂犬病毒為在傳代的人二倍體細胞狂犬病毒，實驗結果顯示，狂犬病毒在人二倍體細胞上能很好生長繁殖，在人二倍體細胞上傳代狂犬病毒10代以內很穩定，10代以上的毒株免疫原性則有明顯下降。即接種人二倍體細胞上的狂犬病毒最好是10代以內的。

收獲的病毒液用?-丙內酯滅活病毒得到的是粗制疫苗。滅活后的粗制疫苗要進行濃縮提純制備成純疫苗，本工藝選用超濾濃縮的方法對粗疫苗進行濃縮，一般是用截留10萬～30萬的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然后純化疫苗。

所述純化包括以下步驟：病毒液先經超濾純化除去部分雜蛋白，再經過蔗糖密度區帶離心，然后經過Sepharose4FF柱層析。