[發(fā)明專利]一種固定化L-天冬酰胺酶反應(yīng)器

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210137793.2
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102816693A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 齊莉;喬娟;李雅萍;木肖玉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號: C12M1/40
• 分類號: C12M1/40;C12N11/14
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種固定化L-天冬酰胺酶反應(yīng)器。

背景技術(shù)

L-天冬酰胺酶是一種從Escherichia?coli中提取的一種藥物，應(yīng)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病（Krejci?O,Starkova?J,Otova?B,Madzo?J,Kalinova?M,Hrusak?O,Trka?J(2004)Leukemia?18:434-441）。自1967年，L-天冬酰胺酶就作為治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的重要組成藥物。這種酶可以水解血清中的L-天冬酰胺導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和損害蛋白質(zhì)的合成。但是這種酶作為藥物存在嚴(yán)重的副作用，包括腎臟毒性、過敏反應(yīng)、胰腺炎及中樞神經(jīng)毒性等，并且會降低凝血因子的合成。為了避免這些副作用，L-天冬酰胺酶可以進(jìn)行化學(xué)修飾，包埋或固定于載體上。其中采用將酶固定于某種材料并且建立體外循環(huán)系統(tǒng)（ESS）具有較好的優(yōu)勢。ESS系統(tǒng)是將L-天冬酰胺酶固定于柱體、中空纖維或血液透析膜等（Jackson?JA,Halvorson?HR,Furlong?JW,Lucast?KD,Shore,JD(1979)J.Pharmacol.Exp.Ther?209:271-274），然后血液流過酶反應(yīng)器酶解血清中的L-天冬酰胺再流回體內(nèi)，實現(xiàn)疾病的治療。這種方法不需要將藥物注入體內(nèi)，因此可以避免副作用的發(fā)生。而為了適應(yīng)這種方法的發(fā)展，需要尋找并建立新的生物相容性良好、低毒性的酶固定化材料。

在過去的幾十年中，酶固定方法可以克服游離酶在酶反應(yīng)過程中的眾多缺點，可以快速、高效和高通量的進(jìn)行酶解研究。許多新發(fā)展的材料已經(jīng)被應(yīng)用于酶的固定化，比如硅材料(Rao?KS,Rani?SU,Charyulu?DK,Kumarb?KN,Lee?BK,Lee?HY,Kawai?T(2006)Anal?ChimActa?576:177-183)、納米顆粒(Mukhopadhyay?K,Phadtare?S,Vinod?VP，Kumar?A,Rao?M,Chaudhari?RV，Sastry?M(2003)Langmuir?19:3858-3863)、碳納米管(Wang?S,Chen?Z,Yang?PY，Chen?G(2008)Proteomics?8:1785-1788)及其它表面固定材料已經(jīng)被應(yīng)用于酶固定。因此尋找新的生物相容性好的酶固定化材料成為生物傳感和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容

針對傳統(tǒng)的固定化酶的載體比表面積小，且容易造成酶失活，儲存穩(wěn)定性差等缺點，本發(fā)明提供了一種新型的納米金固定化L-天冬酰胺酶反應(yīng)器及其制備方法。

本發(fā)明所提供的納米金固定化L-天冬酰胺酶反應(yīng)器是按照包括下述步驟的方法制備得到的：

1）將納米金溶液與L-天冬酰胺酶溶液混勻，室溫攪拌0.5-5小時（優(yōu)選1小時），然后置于2-8℃靜置反應(yīng)12-24小時（優(yōu)選24小時），得到L-天冬酰胺酶-納米金聚集體溶液；

2）制備內(nèi)壁修飾巰基硅烷偶聯(lián)劑的毛細(xì)管柱；

3）將所述L-天冬酰胺酶-納米金聚集體溶液流經(jīng)步驟2）處理后的毛細(xì)管并與其內(nèi)壁充分接觸，在2-8℃放置反應(yīng)12-24小時（優(yōu)選24小時），利用巰基與納米金的反應(yīng)使L-天冬酰胺酶-納米金聚集體固定于毛細(xì)管柱內(nèi)壁，得到納米金固定化L-天冬酰胺酶反應(yīng)器。

其中，步驟1）中所述納米金溶液中納米金的平均粒徑為13-22nm。本發(fā)明中的納米金可采用檸檬酸三鈉法制備得到。

所述L-天冬酰胺酶溶液的濃度為4.5-225.0U/mL。

L-天冬酰胺酶活力測定：在規(guī)定條件下，每分鐘催化L-天冬酰胺水解釋放1μmol氨的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

在制備L-天冬酰胺酶-納米金聚集體時，需保證L-天冬酰胺酶相對于納米金是過量的。

當(dāng)采用如下方法制備納米金溶液時，所述納米金溶液與上述L-天冬酰胺酶溶液的體積比可為1:1-1:5。

納米金溶液制備方法：將氯金酸（1.0mM，10.0mL）煮沸后，快速加入1.0mL新配制的檸檬酸酸三鈉（38.8mM）溶液中，加熱同時快速攪拌，溶液變?yōu)槟G色，進(jìn)而變?yōu)榫萍t色，再繼續(xù)攪拌10分鐘，用三蒸水稀釋3倍后，即得到待用的納米金溶液。

步驟2）中制備內(nèi)壁修飾巰基硅烷偶聯(lián)劑的毛細(xì)管柱的具體方法如下：1）將毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行活化；2）將巰基硅烷偶聯(lián)劑與甲醇按照體積比1:4-1:1進(jìn)行混合（優(yōu)選1:4），將混合溶液流經(jīng)活化后的毛細(xì)管并與其內(nèi)壁充分接觸，然后室溫放置反應(yīng)12-24小時（優(yōu)選12小時），得到內(nèi)壁修飾巰基硅烷偶聯(lián)劑的毛細(xì)管柱。