[發明專利]腦膜炎奈瑟氏菌的特異性檢測和鑒別用引物探針組合和試劑盒

有效

• 申請號: 201210137052.4
• 申請日: 2012-05-07
• 公開（公告）號: CN102643920A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 文鋒
• 申請（專利權）人: 鎮江和創生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/36
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟菌核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。利用本發明的序列組合或試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌核酸，同時鑒別其是否為我國最為流行的A群或C群。該試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌(通用)的檢測限為200拷貝每反應體系，對A群腦膜炎奈瑟氏菌的檢測限為200拷貝每反應體系，對C群腦膜炎奈瑟氏菌的檢測限為200拷貝每反應體系。整個反應可在2小時內完成，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。?

技術背景

腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)是流行性腦脊髓膜炎的病原菌。人類是腦膜炎奈瑟菌的唯一宿主。本菌可定植在人類鼻咽部的粘膜上，稱為攜帶狀態，在健康成人和兒童中本菌的攜帶率可達5％-15％。本菌借飛沫經空氣傳播，冬末春初為流行高峰，被感染者多為青少年和嬰幼兒。感染后多數患者呈攜帶狀態或隱性感染，少數出現上呼吸道感染癥狀，極少數發展成敗血癥，進而累及腦、脊髓膜，形成化膿性腦脊髓膜炎，嚴重者可迅速出現休克和散播性血管內凝血，或頻繁痙攣驚厥，進而昏迷，不及時救治病死率極高。腦膜炎奈瑟菌有13種血清群，我國流行的血清群以A群為主，其次為C群，其他血清群如B、Y、W135和X在我國僅有散發的病例報導。?

在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特?異性是其檢測的特異性和敏感性的基礎。此外，對于已知的致流行性腦脊髓膜炎病原菌的檢測，發現有一些非A群也導致流行性爆發的能力，如C群腦膜炎奈瑟菌。實際檢測過程中，對于一例待測樣品，如果僅僅檢測其中是否有A群腦膜炎奈瑟菌，或者相反，僅僅檢測其中是否有C群腦膜炎奈瑟菌，并不能完全排除其致病性的危險。而分別進行兩次檢測的話，顯然，其檢測的時間成本會大大升高。所以，需要一種能夠檢測多種血清型的腦膜炎奈瑟氏菌，同時對我國兩種主要致流行性腦膜炎奈瑟氏菌(A群和C群)是否存在的試劑和/或方法，以簡化檢測過程。?

本發明分別針對腦膜炎奈瑟氏菌(通用)、腦膜炎奈瑟氏菌A群和腦膜炎奈瑟氏菌C群特異的靶序列設計引物和Taqman探針，利用real-time?PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌核酸，同時鑒別腦膜炎奈瑟氏菌是否為我國最為流行的A群或C群。?

發明內容

為了快速準確地檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌，同時鑒別其血清群是否為我國最為流行的A群或C群。本發明提供一種特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟氏菌(通用)、腦膜炎奈瑟氏菌A群和腦膜炎奈瑟氏菌C群核酸的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于核酸擴增的引物為：?

P1：5`-GGCTGCGGTAGGTGGTTC-3`，?

P2：5`-TTCCAAAGCCACCGTGCG-3`，?

P3：5`-ACGAAGAAATTATGCCACAAAGTG-3`，?

P4：5`-GAAGTCGTCATTGCTGTAAATAAAATAG-3`。?

P5：5`-TTCAATGCTAATGAATACCACCGT-3`，?

P6：5`-GGTATTTGTCTTGAATTTTAGCAATAG-3`。?

P1和P2為針對腦膜炎奈瑟氏菌基因組種特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，可以檢出各種血清型的腦膜炎奈瑟氏菌，P3和P4?為針對腦膜炎奈瑟氏菌A群基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，P5和P6為針對腦膜炎奈瑟氏菌C群基因組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物。?

本發明的的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為：?

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-CCAATGTGCAGCTAACACGTGGCAATG-Y<sub>1</sub>-3`，?

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-CCAGCTTGCACCATATACCAGGAATTAGT-Y<sub>2</sub>-3`。?

Probe3：5`-X<sub>3</sub>-TGCACATTCAGGCGGGATTAGCACA-Y<sub>3</sub>-3`。?