[發明專利]陰道毛滴蟲和白色念珠菌雙通道熒光PCR檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201210136748.5
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN102719529A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 劉巨波;熊麗娟;張陸明;張穎
• 申請（專利權）人: 遼寧科駿生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/725
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明涉及生物技術領域的分子生物學檢測方法，特別是涉及陰道毛滴蟲、白色念珠菌的雙重檢測。

背景技術

毛滴蟲是一種有鞭毛的原蟲，目前發現寄生在人體的毛滴蟲有3種，即口腔毛滴蟲、人毛滴蟲和陰道毛滴蟲（Trichomonas?vaginalis,TV）。前兩種在人類病因學上無意義，而TV寄生在陰道、尿道或膀胱，能引起人的泌尿生殖道疾病，稱為滴蟲病。滴蟲病分為滴蟲性尿道炎、滴蟲性陰道炎、滴蟲性前列腺炎。陰道毛滴蟲引起的女性陰道炎，以泡沫狀陰道分泌物為典型表現。有人報道，陰道毛滴蟲能吞噬精子，導致不孕，還能引起細胞發育異常及細胞核異常，因此，有滴蟲女性的癌癥發生率顯著高于無滴蟲女性。女性患者滴蟲病的癥狀涵蓋從陰道穹窿及子宮頸輕度充血到廣泛糜爛、瘀點及肛周糜爛、顆粒狀易碎及潮紅的子宮內膜（草莓狀子宮頸）。男性患者癥狀輕微，有時表現為慢性前列腺炎的癥狀。滴蟲病與某些其他性傳播疾病的癥狀類似，故單純以臨床癥狀難以做出確診，需用實驗方法檢出陰道毛滴蟲方可確診。TV感染是一種十分常見的性傳播疾病,該病呈全球分布,人群普遍易感。傳染源是滴蟲患者和滴蟲攜帶者，主要通過性交直接傳染，亦可通過被污染的毛巾、公共浴池、游泳池、坐式馬桶、浴缸等物品等間接傳播。世界衛生組織將陰道毛滴蟲病作為性傳播疾病。據WHO報道,全球每年有1.7億人感染TV。除引起泌尿生殖道感染外，TV還是HIV感染和誘發宮頸癌的危險因素之一。女性妊娠中期感染TV常引起胎膜早破、早產、低體重兒等,它也是男性非淋菌性尿道炎的一個重要病因。

念珠菌是一種內源性真菌，它可以侵犯皮膚、粘膜和內臟，表現為急性、亞急性和慢性炎癥。目前發現對人體致病的念珠菌有七種，其中以白色念珠菌（Canidia?Albicans，CA）在臨床上最為常見，其毒力也最強。人生殖器官皮膚粘膜的念珠菌感染稱為生殖器念珠菌病。白色念珠菌可引起女性的外陰及陰道炎癥，主要表現為外陰及陰道瘙癢及陰道分泌物增多并呈豆渣樣白帶，陰道壁粘膜紅腫，有灼燒感。可通過性交傳染給男性，引發男性的念珠菌性龜頭炎和包皮龜頭炎，表現為包皮和龜頭輕度潮紅，龜頭部有紅丘疹，包皮垢異常增多，呈白色乳酪狀。白色念珠菌陰道炎的危害極大：可能會造成暫時性不孕，如果患了念珠菌性陰道炎，陰道的酸堿度的改變會使精子的活動力受到抑制，且炎性細胞可吞噬精子，并使精子活動力減弱；可影響胎兒發育，極少數孕婦陰道中的念珠菌能經宮頸上行，穿透胎膜感染胎兒，引起早產。另外經陰道分娩時，也可能感染引起口腔念珠菌病——鵝口瘡。有些嬰兒還可能出現肛門周圍念珠菌性皮炎；引起其他疾病，若念珠菌性陰道炎長期不治療的話，易造成炎癥上行，引起宮頸炎和宮頸糜爛，如果病原體進入子宮腔，則會引起輸卵管卵巢炎癥、盆腔炎等，最終影響懷孕。

與其他性傳播疾病一樣,這兩種病菌引起的臨床癥狀不典型,臨床確診常借助實驗檢測。常用的方法有：培養法（診斷“金標準”）、涂片染色法、懸滴法、免疫學方法及核酸檢測法等。這些方法在準確性、可靠性、易用性等一個或多個方面有缺點。例如，涂片染色法陽性率低，培養法耗時需要3-7天，且不夠敏感。因此，如何選擇準確、可靠、方便的實驗診斷方法頗為重要,合適的方法能有效減少該病帶來的危害。

發明內容

本發明的第一方面提供了用于在一個反應管中同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行實時熒光PCR檢測的引物和Taqman探針。

在一個實施方案中，對于陰道毛滴蟲檢測，其上游引物序列為SEQID?NO：1或13的核苷酸序列，下游引物序列為SEQ?ID?NO：2或14的核苷酸序列，TaqMan探針為SEQ?ID?NO：3或12的核苷酸序列；對于白色念珠菌檢測，上游引物序列為SEQ?ID?NO:4的核苷酸序列，下游引物為SEQ?ID?NO：5的核苷酸序列，TaqMan探針為SEQ?ID?NO：6的核苷酸序列。

在一個實施方案中，上述TaqMan探針為經過熒光標記的，其5’端標記有報告熒光基團（R），并且3’端標記有熒光淬滅基團（Q）。

在一個實施方案中，上述陰道毛滴蟲TaqMan探針（SEQ?ID?NO：3或12）5’端的報告熒光基團為FAM，3’端的熒光淬滅基團為BHQ₂。在一個實施方案中，白色念球菌TaqMan探針（SEQ?ID?NO：6）5’端的報告熒光基團為HEX，3’端的熒光淬滅基團為BHQ₂。