[發明專利]一種生殖細胞的誘導方法

有效

• 申請號: 201210135878.7
• 申請日: 2012-05-04
• 公開（公告）號: CN103382456A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 賴東梅;王方圓;程蔚蔚;陳一飛;羅欣;王麗;董張麗;楊麗娟
• 申請（專利權）人: 中國福利會國際和平婦幼保健院
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 巫蓓麗

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是一種生殖細胞的誘導方法。?

背景技術

卵巢早衰是指女性在40歲以前出現閉經、不育，雌激素水平低下，促性腺激素濃度過高為特征的一種疾病。小于40歲發病的占婦女總人數的1%-2%，小于30歲發病的約0.1%，是女性不孕不育的常見病因之一。卵巢功能的提早衰竭，使患者過早地喪失生育能力，雌激素水平的下降，導致骨質疏松，心血管疾病風險增加，嚴重影響患者的身心健康和家庭穩定。?

干細胞研究的進展為再生醫學的發展提供了廣闊的空間。干細胞是一群具有自我更新能力，在體內外具有向各個胚層細胞分化潛能的細胞。近年來許多科學家開始進行干細胞向生殖細胞分化的研究。其中研究較多的為胚胎干細胞（Embryonic?stem?cells，ESC），胚胎干細胞是一種具有發育全能性的細胞系，理論上能分化成機體的各種組織細胞，包括生殖細胞。Nicholas等發明一種生殖細胞誘導液，含有BMP4、視黃酸RA、細胞色素P450、CYP26抑制劑、干細胞因子SCF、bFGF等細胞因子，能將小鼠胚胎干細胞在體外誘導為未成熟的卵細胞，進一步可以在小鼠卵巢中發育為成熟卵泡。Clark等研究發現人胚胎干細胞在體外培養形成類胚體時能自發表達生殖細胞分子標記，如DAZL、BOL、SCP1、SCP3、GDF9等；該研究小組又將攜帶GFP的VASA報告基因轉入人胚胎干細胞中，同時加入BMP4進行誘導，發現可以促進人胚胎干細胞向初級卵母細胞及精子細胞發育。還有報道采用失活的豬卵巢成纖維細胞與人胚胎干細胞共培養促進人胚胎干細胞向生殖細胞的分化。然而胚胎干細胞需要破壞人體胚胎，具有倫理缺陷，為解決這一問題，科學家們嘗試采用其他成體細胞進行生殖細胞分化。?

羊水是指受精卵著床后至胎盤發育完成時，由羊膜包裹著的羊膜腔內液體。近年來研究發現羊水細胞可能是非常原始的細胞群，比成體干細胞具有更廣泛的自我更新和多向分化的能力。羊水細胞包括以下3類細胞：（1）上皮類，主要來自胎兒皮膚及尿液中的脫落細胞，培養中出現較早，但隨后數量減少；?（2）羊水特異細胞，能產生雌激素及絨毛膜促性腺激素，推測來自胎膜及滋養細胞；（3）成纖維細胞類，出現較晚，不產生激素，可能起源于間充質。?

羊水細胞基因表達譜和人胚胎干細胞非常相似，它可表達多種干細胞標志基因，其中尤為突出的是Oct-4、Nanog、SSEA-4等胚胎特異性基因。Oct-4、Nanog是維持干細胞分化潛能的主要轉錄因子，干細胞分化后這些基因表達立即下調或消失。階段特異抗原SSEA-3?/SSEA-4?抗原來自移植前胚胎及人類胚胎癌細胞，是葡萄糖酯類的抗原決定簇。因此，羊水細胞具有干細胞特征。De?Coppi等研究發現，羊水干細胞體外增殖迅速，可在倍增250個周期后仍保持較長的端粒酶和正常核型，在體外經誘導可分化為全部3個胚層組織，包括肝細胞、內皮細胞、脂肪細胞、成骨細胞、平滑肌細胞等。Schmidt等利用羊水干細胞體外構建人工心臟瓣膜，該瓣膜具有內皮化及開閉的功能。上述研究提示羊水細胞可能具有向生殖細胞分化的潛能。而我們知道，羊水細胞培養進行胎兒染色體核型分析是孕中期羊水穿刺常規產前診斷項目，在染色體檢查后剩余羊水作為醫療垃圾被廢棄，因此利用羊水細胞作為種子細胞誘導分化獲得生殖細胞將具有廉價、廢物利用、無倫理問題等一系列優點。同樣的，以人皮膚細胞為種子細胞誘導獲得生殖細胞也同時具備上述優點。但是目前尚未有羊水細胞、人皮膚細胞向生殖細胞分化的報道。?

另外，誘導種子細胞向生殖細胞分化需要使用生殖細胞分化因子，目前使用的生殖細胞分化因子價格昂貴，給患者造成極大的經濟負擔。因此，尋找廉價有效的誘導劑也是十分必要的。而目前尚無利用人卵泡液誘導獲得生殖細胞的可行性報道。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種廉價、有效、無倫理問題生殖細胞的誘導方法。?

本發明的再一的目的是，提供一種卵泡液的用途。?

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：?

一種生殖細胞的誘導方法，它是利用卵泡液誘導羊水細胞或皮膚細胞分化為生殖細胞。

所述的羊水細胞經分離和培養為類胚體后再誘導分化為生殖細胞。?

所述的羊水細胞是按照下述方法分離和培養的：采集羊水標本，獲取羊水細胞進行原代培養，原代培養5d后第一次換液，至細胞生長至90%密度后傳代，挑取羊水細胞克隆，用類胚體培養液重懸，調整細胞密度為1×10⁴/ml，培養1d后搖動培養皿，隔日換液。?