[發(fā)明專利]一種含LoxP-FRT重組酶位點(diǎn)的植物雙元表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210135202.8
• 申請(qǐng)日: 2012-05-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102676579A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚磊;閆曉紅;王慧;馬榮才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含LoxP-FRT重組酶位點(diǎn)的植物雙元表達(dá)載體。

背景技術(shù)

隨著技術(shù)的發(fā)展，新的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法在不斷增加。但在眾多的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法中，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法研究的最多，機(jī)理最為透徹。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化因操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法是獲得穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法之一。

根癌農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，是植物病原菌，可以引發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤。農(nóng)桿菌能夠通過(guò)感染植物的傷口，將其Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)整合到植物基因組中。這是自然界中將外源DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的天然方法。Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)段的左右兩端各有一個(gè)高度保守的25bp長(zhǎng)的同向不完全重復(fù)序列（LB和RB）。在農(nóng)桿菌對(duì)植物的轉(zhuǎn)化中RB先進(jìn)入植物細(xì)胞，隨后外源基因及LB進(jìn)入。原始的農(nóng)桿菌T-DNA上編碼的部分基因可以破壞植物細(xì)胞內(nèi)源激素的平衡，干擾植物正常新陳代謝，引發(fā)植物腫瘤的形成。T-DNA的切除和轉(zhuǎn)移是由Ti質(zhì)粒的致毒（Vir）區(qū)基因編碼的蛋白完成。

在所有的Ti質(zhì)粒中，T-DNA區(qū)和Vir區(qū)是兩個(gè)不同的區(qū)域。這是農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。人們利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的原理，開(kāi)發(fā)了植物表達(dá)雙元載體系統(tǒng)。一個(gè)雙元載體系統(tǒng)是由兩個(gè)分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒組成。通常實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的雙元載體為已去除了T-DNA中與干擾植物新陳代謝相關(guān)的基因，只含有T-DNA的兩端邊界序列。輔助質(zhì)粒為含有Vir區(qū)段，但T-DNA缺失，完全喪失了致瘤的功能；其作用是提供Vir基因功能，激活T-DNA轉(zhuǎn)移。為了使雙元Ti載體能夠穿梭在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中，并能自我復(fù)制，在這些質(zhì)粒中常用到廣譜復(fù)制原點(diǎn)，如pBIN19及其Ti質(zhì)粒用到的pRK2。雙元Ti質(zhì)粒也可有兩個(gè)復(fù)制原點(diǎn)(oris)；如pCGN系列質(zhì)粒，一個(gè)用于大腸桿菌(如來(lái)自pColE1)，另一個(gè)用于農(nóng)桿菌(如來(lái)自pRi)。

早期雙元載體pBIN19等的T-DNA區(qū)常克隆自野生型Ti質(zhì)粒（如pTiT37）。后來(lái)人們才人工合成了25bp重復(fù)結(jié)構(gòu)的LB和RB片段。LB和RB之間序列常為一個(gè)選擇標(biāo)記基因（編碼抗生素或除草劑）表達(dá)框和一些多克隆位點(diǎn)（MCS）。有的還含有一個(gè)用于藍(lán)白斑篩選的缺陷型β-半乳糖苷酶基因（LacZ）。早期盡管人們已對(duì)Ti載體進(jìn)行修改，但載體通常都很大（超過(guò)10kb），MCS位點(diǎn)少，且在大腸桿菌中拷貝數(shù)很低。離體的重組效率與質(zhì)粒DNA的大小成反比。為了能滿足轉(zhuǎn)化大片段DNA的需要，雙元Ti載體應(yīng)盡量最小化。隨著人們對(duì)雙元載體的不斷改進(jìn)，這些缺陷正逐漸減少。

隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性意識(shí)的提高，無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物成為商業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者陸續(xù)開(kāi)發(fā)了多種有效的策略。利用Cre或Flp重組酶，在獲得轉(zhuǎn)基因植株后將選擇標(biāo)記基因去除是研究最為詳細(xì)、應(yīng)用最廣的技術(shù)之一。雖然這些策略在刪除標(biāo)記基因上取得了成功，但在載體的構(gòu)建過(guò)程中由于經(jīng)過(guò)多次的亞克隆步驟，最終能用于目的基因工程操作的MCS變得非常稀少，妨礙了后期的基因工程操作。現(xiàn)在常用的植物轉(zhuǎn)化雙元載體（如pGreen、pCAMBIA等系列）雖然有著諸多的優(yōu)點(diǎn)，方便基因工程操作，但其主要是為基礎(chǔ)研究所創(chuàng)造，沒(méi)有為后期將植物篩選標(biāo)記去除做準(zhǔn)備。這就使其在植物遺傳轉(zhuǎn)化商業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種載體。

本發(fā)明提供的載體，為環(huán)狀雙鏈DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大腸桿菌復(fù)制起始原點(diǎn)ColE1、農(nóng)桿菌復(fù)制起始原點(diǎn)Rep-ori、調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ep表達(dá)框、T-DNA超驅(qū)動(dòng)區(qū)、T-DNA右邊界、T-DNA左邊界和Kan抗性基因表達(dá)框。

上述載體中，所述大腸桿菌復(fù)制起始原點(diǎn)ColE1為序列表中序列4自5’末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列1自5’末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1-589位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；

所述農(nóng)桿菌復(fù)制起始原點(diǎn)Rep-ori為序列表中序列4自5’末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；也為序列表中序列1自5’末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列2自5’末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；序列表中序列3自5’末端第590-1385位核苷酸所示的雙鏈DNA片段；