[發(fā)明專利]一種miRNA檢測探針和可視化檢測miRNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210133660.8
• 申請日: 2012-05-03
• 公開（公告）號: CN102618664A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周翔;王少儒;田沺;翁小成;肖珩
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學和核酸化學領(lǐng)域，涉及一種miRNA檢測探針和可視化檢測miRNA的方法。

背景技術(shù)

MicroRNAs(miRNAs)是真核細胞中發(fā)現(xiàn)的一類有調(diào)控功能的非編碼RNA，通常大約有20～25個核苷酸。miRNAs是由較長的含有hairpin結(jié)構(gòu)的前體經(jīng)過Dicer酶的剪切加工形成的，隨后與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISCs)結(jié)合，并通過堿基互補配對識別相應(yīng)的信使RNA(mRNA)。由于互補程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA阻遏靶mRNA的翻譯。miRNA在動植物中有廣泛表達，參與細胞增殖凋亡、發(fā)育、病毒防御、造血、器官形成、脂肪代謝等多種調(diào)節(jié)過程。miRNA具有保守性，特異性和時序性，只在特定的細胞和組織中表達，因此決定了細胞和組織功能的特異性。區(qū)別于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA3’端為羥基，5’端有一個磷酸基。目前，miRNA的功能僅被部分闡明，近年來，有報道m(xù)iRNA與細胞癌變具有密切關(guān)聯(lián)。miRNA的功能類似于癌基因或抑癌基因，有些miRNA會協(xié)同行使癌基因的功能，使一些凋亡蛋白受到抑制而另外一些miRNA在正常組織中高表達，它們的缺失或低表達可以導(dǎo)致細胞的轉(zhuǎn)化和一些癌基因的激活。因此，miRNA可以作為一個重要的腫瘤標識物，針對miRNA的檢測對于早期診斷和愈后診斷有重要意義，同時也為其功能研究提供重要依據(jù)。

miRNA由于同源性高，長度較短，細胞或組織內(nèi)含量低，針對它的高靈敏高選擇性檢測方法仍然有待進一步完善。目前的miRNA檢測方法仍然以傳統(tǒng)的Northern?Blot為主，依賴于轉(zhuǎn)印跡與雜交。這種方法主要的缺點在于工作流程長，操作復(fù)雜，費時，同時需要的樣本量大，靈敏度有限，而且探針需要放射性或堿性磷酸酶等標記，這些都產(chǎn)生環(huán)境污染與資源浪費。近年發(fā)展了一些新的檢測方法。芯片技術(shù)的發(fā)展為高通量檢測及篩選帶來重大突破，芯片的應(yīng)用結(jié)合不同標記包括堿性磷酸酶，熒光標記，量子點納米金等，提供了多種信號放大的途徑，大大提高了檢測的靈敏度。但是芯片及各種標記法均帶來檢測成本的提高。隨后，分子信標的應(yīng)用為miRNA的檢測帶來了新的途徑，但是在檢測miRNA的應(yīng)用中由于miRNA長度的限制，使得分子信標環(huán)狀區(qū)的長度局限于20-25個堿基左右，因而往往無法完全打開莖稈區(qū)而僅產(chǎn)生較低信號，同時分子信標熒光的產(chǎn)生只能是線性擴增，放大倍數(shù)不高。隨后，RT-PCR的應(yīng)用，滾環(huán)擴增，恒溫指數(shù)擴增等均發(fā)展用來檢測miRNA，這些方法各有優(yōu)勢，但是復(fù)雜的標記及探針設(shè)計，儀器的要求等仍然限制著它們的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種miRNA檢測探針和高靈敏低成本檢測miRNA的方法。

本發(fā)明是基于G-四鏈體與血紅素Hemin形成的復(fù)合物具有過氧化物酶活性，催化底物2，2′聯(lián)氮雙(3′-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)被過氧化氫氧化，產(chǎn)生綠色產(chǎn)物。

本發(fā)明的探針在靶標miRNA存在的條件下被雙鏈特異性內(nèi)切酶的酶切后釋放出G-四鏈體形成序列，在鈉鉀離子及Hemin的共同作用下形成有過氧化物酶活性的復(fù)合物，對過氧化氫催化底物ABTS反應(yīng)，產(chǎn)生綠色產(chǎn)物。此過程可肉眼觀察，從而實現(xiàn)miRNA的可視化檢測。工作原理如圖1所示。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的檢測探針如下：

一種miRNA檢測探針，包括三個部分：靠近3′端為G-四鏈體形成序列，中間是待測靶標互補序列，5′端為干擾序列；

所述G-四鏈體形成序列含有4段GGG序列參與G-四鏈體形成；

所述待測靶標互補序列為loop環(huán)，與相應(yīng)的靶miRNA完全互補；

所述干擾序列有5-10個與G-四鏈體形成序列互補的堿基。

所述G-四鏈體形成序列在非工作條件下，與干擾序列互補配對而不形成G4，整個探針為hairpin結(jié)構(gòu)。僅當有待測靶標存在時，hairpin結(jié)構(gòu)打開，在雙鏈特異內(nèi)切酶的作用下，G4序列被釋放出來形成四鏈體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生過氧化物酶活性。