[發明專利]一種龍腦樟細胞懸浮培養液及懸浮培養方法

無效

• 申請號: 201210132064.8
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN103374544A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 李惠華;蘇明華;徐劍;劉小英;常強;王偉;何恩銘
• 申請（專利權）人: 福建省亞熱帶植物研究所
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02;C12N5/04
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及龍腦樟細胞懸浮培養方法。?

背景技術

天然右旋龍腦(天然冰片)是龍腦樟中最重要的次生代謝物質，天然龍腦是一種名貴中藥材和高級香料，也是重要的化工原料，是國際市場緊俏商品，傳統上，天然龍腦都是通過的提取龍腦樟樹葉的方法獲得。由于龍腦樟資源稀少，種源奇缺，因而，不能滿足市場需求。?

現有技術中，對龍腦樟的組織培養研究主要集中在愈傷組織培養，和無性快繁體系的建立。植物細胞懸浮培養途徑生產次生代謝產物是目前中藥生產中的重要技術路線，但目前在龍腦樟研究中，尚無建立懸浮培養體系以提取右旋龍腦的報道。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種龍腦樟細胞懸浮培養方法，來生產天然右旋龍腦，以解決現有技術中存在的上述問題。?

本發明提供的技術方案如下：?

技術方案一：?

一種用于龍腦樟細胞懸浮培養的培養液，包括：?

MS基本培養基?

2，4-D??1.5-2.5mg/L；?

6-BA??0.4-0.8mg/L；?

LH(水解乳蛋白)100-1000mg/L；?

椰汁0-250mg/L；?

CH(酸水解酪蛋白)500-1500mg/L；和?

蔗糖2-5％。?

更佳地，本發明采用如下的培養液：MS基本培養基+2mg/L?2，4-D+0.6mg/L?6-BA+150?mg/L椰汁+500mg/L?CH+3％蔗糖。?

本發明的培養基，其PH值根據需要，可在5.0-7.0，更佳地為5.4-6.2，最佳為5.8?

技術方案二：?

一種龍腦樟細胞懸浮培養方法，包括如下步驟：?

(1)培養獲取龍腦樟愈傷組織；?

(2)提供前述的龍腦樟細胞懸浮培養液；?

(3)愈傷組織在懸浮培養液中進行懸浮培養；?

(4)收獲細胞，提取右旋龍腦。?

在本發明的較佳實施例中，用于懸浮培養的愈傷組織為淡白色、生長狀態良好、質地疏松的龍腦樟幼莖誘導而來的愈傷組織。獲得愈傷組織可以采用現有技術。繼代4次后，轉入懸浮培養。?

在本發明的較佳實施例中，步驟(3)的培養包括初代培養和繼代培養，培養的光照強度為0-3000Lux；光照采用白光、紅光或藍光；光照方式采用連續光照方式。?

在本發明的較佳實施例中，步驟(3)的接種量為40-60g/L。?

在本發明的較佳實施例中，培養18-24天后收獲細胞，提取右旋龍腦。?

在本發明的較佳實施例中，步驟(4)收獲細胞的前3天在16℃條件下培養3天。?

在本發明的較佳實施例中，搖床轉速為90-130r/min，最佳地，為110r/min。?

一種龍腦樟細胞懸浮培養方法，細胞懸浮培養基配方為：MS基本培養基+2mg/L2，4-D+0.6mg/L?6-BA+500mg/L?LH+500mg/L?CH+150ml/L椰汁+3％蔗糖，pH值為5.8；外界調控條件為：光照強度為2000Lux的白光連續照射，培養5天后置于16℃低溫環境下處理3天，采用250ml的三角瓶裝液80ml，接種量為40g/L·FW，搖床轉速為110r/min，采用透氣膜封口，培養21天收獲。?

由于傳統的龍腦提取方法不能滿足市場需求，本發明提供了用于龍腦樟細胞懸浮培養的培養液以及培養方法。本發明以龍腦樟組培瓶苗為材料，進行優良愈傷組織的誘導，優良愈傷組織經過多次繼代培養轉入液體培養基，繼而進行懸浮培養條件的篩選同時檢測目?標產物右旋龍腦含量，從而建立了龍腦樟愈傷組織懸浮培養體系，可進一步進行右旋龍腦產業化生產。其中，采用最佳方式培養，龍腦樟細胞培養物中右旋龍腦的得率為3.81μg/g·DW。比初始愈傷組織中(2.6698μg/g·DW)的右旋龍腦含量提高了約42％。?

附圖說明

圖1收獲時間對懸浮培養細胞生長和右旋龍腦含量的影響。?

具體實施方式

試驗材料：由龍腦樟優良單株誘導而來的龍腦樟組培無菌瓶苗(高約2～5cm，一個月繼代一次，繼代了一年零六個月)，來自福建省亞熱帶植物研究所和地緣(廈門)生物科技有限公司。?