[發明專利]腸道病毒71型阜陽株及其減毒株的cDNA感染性克隆及應用

有效

• 申請號: 201210130398.1
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN103374580A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 岑山;張永欣;李曉宇;周永東
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C07K14/085;C12N1/21;C12N7/01;A61K39/125;A61P31/14;C12R1/93;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及RNA病毒拯救技術，具體地說，涉及腸道病毒71型阜陽株及其減毒株的cDNA感染性克隆及應用。

背景技術

腸道病毒(Enterovirus)71型(EV71)屬于小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬。基因組為單股正鏈RNA。EV71主要感染5歲以下的兒童，通過糞-口途徑或飛沫進行傳播，其感染主要引起手足口病(HFMD)，在臨床上與柯薩奇病毒A16感染所引起的手足口病難以區別。嚴重的EV71感染還能引起無菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹以及心肌炎和肺水腫等多種與神經系統相關的疾病，導致重癥甚至死亡病例的發生。EV71自1969年首次由Schmidt等從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來后，已在世界范圍內引起十多次的爆發和流行。近年來，EV71的流行在亞太地區呈上升趨勢，令人關注的是該地區的EV71感染引起越來越嚴重的中樞神經系統癥狀。2008年和2009年以EV71感染為主的手足口病在中國大陸多個省市流行，共導致479名兒童死亡。目前尚無治療EV71感染的特效藥物，主要通過對癥治療控制病情的發展。

EV71的基因組為長約7400個核苷酸的單股正鏈RNA，含有一個開放閱讀框(ORF)，可編碼一條2193個氨基酸的多聚蛋白，包括編碼結構蛋白的P1區(VP4、VP2、VP3、VP1)以及編碼非結構蛋白的P2區(2A、2B、2C)和P3區(3A、3B、3C、3D)。基因組兩側分別為5’非編碼區(5’-UTR)和3’非編碼區(3’-UTR)，對于病毒的復制，病毒蛋白的翻譯及基因組RNA的感染性具有重要作用。研究證實與EV71同屬腸道病毒的脊髓灰質炎病毒，其5’-UTR區、VP1以及3C蛋白酶和3D聚合酶的編碼區和3’-UTR區存在神經毒力決定位點，推測EV71的神經毒力決定簇也位于這些區域中。McMinn等通過比對1999年澳大利亞EV71流行株的VP1基因序列，發現臨床癥狀表現為手足口病的毒株和具有神經毒性的毒株主要區別位于VP1蛋白第170位氨基酸丙氨酸到纈氨酸的替換。該位點的變化可能導致了VP1蛋白空間結構的改變，從而使病毒與宿主細胞的結合能力和病毒的毒力發生改變。2005年，Arita等通過在EV71標準株BrCr的cDNA感染性克隆中引入一系列突變，證明了在獼猴模型中，位于5’-UTR區、VP1結構蛋白和3D聚合酶編碼區以及3’-UTR區的決定溫度敏感性的突變位點可以減弱病毒的神經毒力。2011年，Phuektes等通過在兩株細胞生長表型不同的EV71毒株的感染性克隆之間進行5’-UTR區、P1區和P2-P3-3’-UTR區的置換，證明兩株病毒的生長表型差異是由P1區和P2-P3-3’-UTR區共同決定的，單一區段的對換對表型的影響并不完全匹配。許多研究也證明臨床表現不同的毒株基因組序列的差異并不大，從而提示EV71的毒力決定位點并非為單一位點，可能受到多個基因組功能區域的共同影響。此外，宿主的免疫應答反應對病毒的毒力也有影響。

應用反向遺傳學技術構建RNA病毒的感染性克隆，可以通過基因工程的技術手段較容易地實現對病毒基因組的改造，如定點突變、重組、缺失和嵌合等，為闡明病毒的致病機制，定位病毒的毒力決定簇、研發新的抗病毒藥物及獲得新的疫苗候選株奠定重要的基礎。

發明內容

本發明的目的是提供腸道病毒71型阜陽株及其減毒株的cDNA感染性克隆及應用。

為了實現本發明目的，本發明的腸道病毒71型阜陽株的cDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作獲得的腸道病毒71型阜陽株的cDNA感染性克隆。

前述的腸道病毒71型阜陽株的cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第930位蛋氨基酸替換為精氨基酸，或將第1152位精氨基酸替換為賴氨基酸，均不會影響其功能。

前述的腸道病毒71型阜陽株的cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。

本發明還提供含有上述腸道病毒71型阜陽株的cDNA感染性克隆的載體。優選地，出發載體為pBR322。