[發(fā)明專利]一種新的單克隆抗體的制備方法及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210130232.X
• 申請日: 2012-04-27
• 公開（公告）號: CN103374068A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫兵;伊春艷;邊超;凌志洋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/06;C12N15/85;C12N15/63;G01N33/543;A61K48/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更特別地，本發(fā)明涉及一種新的單克隆抗體的制備方法及用途，適合于大規(guī)模的制備能夠識別天然抗原表位的單克隆抗體。

背景技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具，其在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面有著不可或缺的作用，在人類和動物的免疫學(xué)診斷方面至今仍有著無可替代的重要作用。

單克隆抗體技術(shù)的基本原理為：小鼠受到外界抗原刺激后可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這一職能是由B淋巴細(xì)胞來承擔(dān)。腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以無限傳代，是永久細(xì)胞。把小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)過免疫的小鼠脾細(xì)胞在聚乙二醇等介導(dǎo)下發(fā)生融合，融合后的雜交瘤細(xì)胞具有兩種細(xì)胞的特性，一方面可以分泌特異性的抗體，一方面也具備了腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力、可在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)無限增殖，從而分泌大量單克隆抗體。

免疫方法和篩選抗原是決定能否獲得高親和力、能識別天然抗原表位的單抗的重要因素。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一種細(xì)菌質(zhì)粒，在克隆了特異性的基因以后，能在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白抗原，刺激機體產(chǎn)生特異性的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。與其他免疫的方法相比，DNA疫苗具有以下優(yōu)點：沒有感染的風(fēng)險；誘發(fā)針對天然蛋白表位的抗體，長期持續(xù)的免疫反應(yīng)；便于構(gòu)建具有協(xié)同作用的細(xì)胞因子疫苗；純化容易，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性不受溫度影響。DNA免疫存在的一個關(guān)鍵問題是如何提高DNA疫苗的免疫原性和體液免疫反應(yīng)。當(dāng)前主要的研究方向集中在優(yōu)化DNA疫苗的本身構(gòu)建、佐劑和接種方案和途徑。

免疫動物的血清抗體效價評估和篩選能分泌特異性識別抗原的雜交瘤細(xì)胞需要高質(zhì)量的抗原。利用原核和真核系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白存在著明顯缺陷：大腸桿菌表達(dá)的蛋白不能被修飾和正確的折疊，篩選到的單抗往往不能識別天然結(jié)構(gòu)的抗原；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)蛋白實驗周期長，產(chǎn)量低，成本高，一些蛋白較難表達(dá)例如轉(zhuǎn)錄因子。用來評價抗體滴度和篩選雜交瘤細(xì)胞的抗原的獲得是限制單克隆抗體制備的瓶頸。

因此，需要開發(fā)簡易的單克隆抗體免疫策略和篩選方法，以用于大規(guī)模的制備能夠識別天然抗原表位的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新的單克隆抗體的制備方法及用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種篩選單克隆抗體的方法，包括：

(1)提供構(gòu)建物1，該構(gòu)建物1包括(5’→3’)：表達(dá)盒1，其包括(5’→3’)啟動子1、生物素連接酶BirA編碼基因、終止子1；和表達(dá)盒2，其包括(5’→3’)啟動子2、AviTag編碼基因、抗原編碼基因、終止子2；

將構(gòu)建物1轉(zhuǎn)染(如瞬時轉(zhuǎn)染)哺乳動物細(xì)胞，表達(dá)獲得生物素化的抗原，裂解細(xì)胞獲得含有生物素化抗原的裂解液；

(2)提供構(gòu)建物2，該構(gòu)建物2包括(5’→3’)：表達(dá)盒3，其包括(5’→3’)啟動子3、信號肽編碼基因、GM-CSF編碼基因、終止子；和表達(dá)盒4，其包括(5’→3’)啟動子4、信號肽編碼基因、抗原編碼基因；

將構(gòu)建物2免疫哺乳動物，取哺乳動物脾臟細(xì)胞制備雜交瘤細(xì)胞；

(3)將步驟(1)獲得的含有生物素化抗原的裂解液與包被有親和素的固相載體接觸，從而生物素化的抗原被固定于固相載體；以該生物素化的抗原來篩選步驟(2)獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，獲得特異性抗所述抗原的單克隆抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備生物素化抗原的方法，包括：

提供構(gòu)建物1，該構(gòu)建物1包括：表達(dá)盒1，其包括啟動子1、生物素連接酶BirA編碼基因、終止子1；和表達(dá)盒2，其包括啟動子2、AviTag編碼基因、抗原編碼基因、終止子2；

將構(gòu)建物1轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，表達(dá)獲得生物素化的抗原。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備抗體的方法，包括：提供構(gòu)建物2，該構(gòu)建物2包括：表達(dá)盒3，其包括啟動子3、信號肽編碼基因、GM-CSF編碼基因、終止子；和表達(dá)盒4，其包括啟動子4、信號肽編碼基因、抗原編碼基因；

將構(gòu)建物2免疫哺乳動物，獲得哺乳動物的免疫血清，其中包括抗所述抗原的多克隆抗體；或?qū)?gòu)建物2免疫哺乳動物，獲取哺乳動物的脾臟細(xì)胞，制備單克隆抗體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種評估抗體的效價的方法，包括：

提供構(gòu)建物1，該構(gòu)建物1包括：表達(dá)盒1，其包括啟動子1、生物素連接酶BirA編碼基因、終止子1；和表達(dá)盒2，其包括啟動子2、AviTag編碼基因、抗原編碼基因、終止子2；