[發明專利]一種白色念珠菌的PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201210130061.0
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN102634594A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 劉生峰;肖進文;李應國;歐陽珂珮;周慶;王國民;李賢良;聶福平;王昱
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;劉生峰
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種用于檢測白色念珠菌的PCR方法。

背景技術

白色念珠菌（Candida?Albicans）又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，為條件致病性。白色念珠菌是導致真菌感染的重要致病菌之一，此外它還是重要食源性致病菌。因此建立的白色念珠菌PCR檢測方法在醫學臨床檢驗，食品安全檢測領域都具有重要應用價值。

白色念珠菌引起淺表性感染和深部感染，該種菌引起的相關疾病有皮膚念珠菌病，包括指（趾）間糜爛,多見于長期從事潮濕作業的人、念珠菌性間擦疹多見于小兒和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多見于肥胖兒童、念珠菌性甲溝炎、甲床炎多見于指甲；粘膜念珠菌病，包括多見于嬰幼兒患者的鵝口瘡，以及生殖器念珠菌病；而深部感染疾病則包括內臟念珠菌病，該感染可累及全身所有內臟器官，其中以腸念珠菌病及肺念珠菌病較常見。念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌病。常侵犯皮膚、粘膜，也可引起內臟或全身感染，臨床癥狀錯綜復雜，急緩不一，兒童多為急性繼發性感染。近年來隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的應用，以及器官移植術的開展，其發病率漸趨增高，并可危及生命造成嚴重后果。

目前，有關白色念珠菌快速檢測的相關報道多見于國內外醫學領域，在食品檢測方面尚屬空白。國內外也沒有出臺相關的行業標準，目前國內廣泛采用的方法是，選用營養豐富的培養基從待檢樣本中分離培養可能存在的白色念珠菌、再根據培養基上的菌落形成情況，借助顯微鏡開展形態鑒定、配合其他生化特征進行鑒定的檢驗方法，該方法相對操作復雜，檢驗周期較長。

發明內容

本發明的目的是建立一種白色念珠菌的快速檢測方法，可用于醫學臨床檢驗和食品樣本檢驗。

實現本發明的具體技術方案如下：

一種白色念珠菌的PCR檢測用引物的核苷酸序列為：上游引物SEQ?ID?NO1和下游引物SEQ?ID?NO2。

一種利用上述引物的白色念珠菌的PCR檢測方法，包括以下步驟：

1）待檢樣品增菌培養。將待檢樣品接種于沙氏葡萄糖肉湯培養基，30℃培養48～72小時。

2）提取待檢樣品的核酸。

3）PCR擴增反應

擴增體系：每25μL擴增體系中包含10×PCR緩沖液2.5μL，10?mmol/L?dNTP?混合液2.5μL?，25?mmol/L?MgCl_2?2.5μL，5U/μL?Taq聚合酶0.2μL，?25μmol/L?SEQ?ID?NO1和SEQ?ID?NO2各0.5μL，步驟2）所獲核酸溶液1μL，超純水補體積至25μL；

擴增參數：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，擴增35個循環，最后一個循環于72℃延伸5min。

4）將步驟3）中的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

5）結果分析：若有擴增產物目的條帶（235bp）出現則待測樣品中有白色念珠菌，否則沒有。

與現有的傳統白色念珠菌檢測方法相比，本發明主要優點在于：

1、特異性高：一對引物對白色念珠菌的基因組特異性區域識別，保證PCR擴增的高度特異性，傳統方法則需要鑒別菌落特征、形態特征和生化試驗，進行檢測。

2、檢測周期短：對于未知樣本進行檢測在完成增菌后，4個小時即可完成PCR檢測和結果的報告，而傳統方法完成增菌后還要3天以上的時間。

3、穩定性高：同一樣品經不同的人完成檢測，結果的一致性強，尤其適用于大規模、高通量樣品的檢測分析，一次可以處理幾十個樣本。

附圖說明

圖1為白色念珠菌PCR檢測結果示意圖；

圖2為白色念珠菌PCR檢測方法特異性實驗電泳結果圖；

圖中：M-DL2000核酸分子量標準；1.1-陽性對照；1.2-陰性對照；1.3-陰性樣品；2.1-陰性對照；2.2-白色念珠菌；2.3-光滑念珠菌；2.4畢赤酵母；2.5-釀酒酵母；2.6-異常漢遜酵母。

具體實施方式

結合實例對本發明做進一步說明，不當作對本發明的限制。

實施例1??食品樣品中白色念珠菌的PCR檢測

取均質后待檢樣品25g接種于225mL沙氏葡萄糖肉湯培養基中，30℃培養48～72?小時。