[發明專利]普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達的磷酸肌醇3-激酶EST片段

無效

• 申請號: 201210129954.3
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN102634498A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 程在全;黃興奇;蔣春苗;余騰瓊;殷富有;張敦宇;李定琴;鐘巧芳;李維蛟;王玲仙;付堅;蔣聰;王波;陳玲;李娥賢;羅紅梅
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

技術領域

本發明屬于生物分子克隆技術領域，具體涉及白葉枯病菌脅迫下的普通野生稻磷酸肌醇3-激酶表達序列標簽（Expressend?Sequence?Tag,?EST），并基于該EST片段設計引物，通過半定量RT-PCR檢測該磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中的差異表達方法。

背景技術

目前抗白葉枯病菌基因的發掘主要是通過已知的抗病基因提供的信息進行分離克隆，很難獲得新的抗白葉枯病基因。由于白葉枯病病原菌生理小種的不斷變異使得栽培稻中原有的抗白葉枯病基因逐漸喪失抗性，而目前對白葉枯病的防治，尚未有行之有效的措施。普通野生稻（Oryza?rufipogon?Griff.）對各種病蟲害抗性強，高抗白葉枯病，甚至免疫，（廣東省農科院水稻所野生稻研究組.?普通野生稻種質資源抗性鑒定[J].廣東農業科學，2:3-6,?1989；林世成等.?普通野生稻對水稻白葉枯病抗性的評價及遺傳研究初報[J].?中國水稻科學，6(4):155-158，1992.?），因此，通過發掘普通野生稻中高抗白葉枯病的新基因，并從中克隆分離抗病相關基因，對水稻抗病育種具有重要意義。

磷脂酰肌醇3?-激酶(?phosphoinositide-3-kinase，PI3K)?是一種與細胞內信號傳導有關的脂類第二信使。正常情況下，它們不存在未受刺激的細胞中。一旦細胞受到刺激，它們就迅速產生。PI3K?是細胞內一個重要的分子，PI3K?家族在細胞的增殖、抗凋亡、細胞遷移、膜泡轉運、細胞癌性轉化等眾多過程有關的信號轉導方面起重要作用（楊章民,?王一理,司履生.?磷酯酰肌醇-3?激酶家族研究進展[J].?國外醫學:?分子生物學分冊，2003，25：285-289.；邱定紅.?磷脂酰肌醇-3?激酶研究概況[J].?國外醫學:?遺傳學分冊，2000，23：30-32.）。本研究從白葉枯病菌脅迫的普通野生稻SSH文庫中獲得一個EST片段，在NCBI中經BLASTn比對分析，與已知的磷酸肌醇3-激酶基因的同源性為81%，推測該EST片段編碼的蛋白為磷脂酰肌醇-3?激酶，故將該EST片段暫命名為磷脂酰肌醇-3?激酶EST片段。

表達序列標簽(Expressed?Sequence?Tags，ESTs)是指從不同組織來源的cDNA序列，這一概念首次由Adams等于1991年提出。近年來由此形成的技術路線被廣泛應用于基因識別、繪制基因遺傳圖譜和物理圖譜、定位克隆、尋找新基因、研究基因的功能等研究領域，并且取得了顯著成效。

發明內容

本發明目的是克服現有栽培稻中原有的抗白葉枯病基因逐漸喪失，因而缺乏抗白葉枯病的新基因的缺陷和不足，提供一新的普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達的磷酸肌醇3-激酶EST片段，該磷酸肌醇3-激酶EST片段是與抗白葉枯病相關的基因片段，還提供一種擴增該磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物,一種檢測磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差異表達的方法及其引物，從而為進一步從普通野生稻中分離克隆抗病相關基因奠定基礎。

本發明所提供的普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達的磷酸肌醇3-激酶EST片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

本發明所提供的擴增所述的普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達的磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

本發明還提供了一種檢測磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差異表達的引物，它是由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

本發明所提供的一種檢測磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差異表達的方法，包括以下步驟：?

1．總RNA?的提取

1）樣品的處理

A、待檢測樣品的處理，用白葉枯病菌菌液接種普通野生稻葉片后，每隔24?h，分別于24?h、48?h、72?h、96?h、120?h?5個時期收集接種該普通野生稻葉片，分別置于研缽中加液氮快速磨碎，每100?mg樣品加入1?ml?TRIzol提取液，渦旋振蕩15s，每個時期的取樣為一個處理樣品，共5個處理樣品；