[發(fā)明專利]普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達(dá)的磷酸肌醇3-激酶EST片段

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210129954.3
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN102634498A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程在全;黃興奇;蔣春苗;余騰瓊;殷富有;張敦宇;李定琴;鐘巧芳;李維蛟;王玲仙;付堅(jiān);蔣聰;王波;陳玲;李娥賢;羅紅梅
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12N15/54;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 昆明合眾智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 康珉

1.普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達(dá)的磷酸肌醇3-激酶EST片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的普通野生稻中受白葉枯病菌脅迫表達(dá)的磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物，它由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

3.一種檢測磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差異表達(dá)的引物，它是由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

4.一種檢測磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差異表達(dá)的方法，包括以下步驟：?

1．總RNA?的提取

1）樣品的處理

A、待檢測樣品的處理，用白葉枯病菌菌液接種普通野生稻葉片后，每隔24?h，分別于24?h、48?h、72?h、96?h、120?h?5個(gè)時(shí)期收集接種該普通野生稻葉片，分別置于研缽中加液氮快速磨碎，每100?mg樣品加入1?ml?TRIzol提取液，渦旋振蕩15s，每個(gè)時(shí)期的取樣為一個(gè)處理樣品，共5個(gè)處理樣品；

B、對(duì)照組的處理，以滅菌雙蒸水代替白葉枯病菌菌液接種普通野生稻葉片作為對(duì)照組，每隔24?h，分別于24?h、48?h、72?h、96?h、120?h?5個(gè)時(shí)期收集接種該普通野生稻葉片，分別置于研缽中加液氮快速磨碎，每100?mg樣品加入1?ml?TRIzol提取液，渦旋振蕩15s，每個(gè)時(shí)期的取樣為一個(gè)對(duì)照樣品，共5個(gè)對(duì)照樣品；

2）將步驟1）所述的樣品在15～30℃放置5?min；加入氯仿，氯仿的用量為每使用1?ml?TRIzol加入200?μl氯仿，蓋好管帶，渦旋振蕩15?s，15～30℃放置3?min；

3）4℃，12000?rpm離心15?min，此時(shí)溶液分為三層：黃色的是有機(jī)相，中間層和上層無色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相轉(zhuǎn)移至另一新的無RNase離心管中；

4）向得到的水相中加入等體積的異丙醇，混勻，15～30℃放置20-30?min；

5）4℃，12000?rpm離心10?min，棄上清；

6）加入DEPC水配制的體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液洗滌沉淀，用量為每使用1?ml?TRIzol用1?mlDEPC水配制的體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液；

7）4℃，5000?rpm離心3?min，用槍頭小心吸出上層液體，保留沉淀；

8）15～30℃晾干2-3?min，加入30-100?μl無RNase的雙蒸水，充分溶解RNA后，5個(gè)對(duì)照樣品RNA混合作為一個(gè)總對(duì)照樣品于-70℃保存，5個(gè)時(shí)期的處理樣品分別于-70℃保存；

2．cDNA第一鏈的合成

1）在PCR管中依次加入下列成分，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中各個(gè)時(shí)期的總RNA濃度均為3μg：

Oligo(dT)₁₈?????????2?μl

dNTP(2.5mM?each)???2?μl

RNA???????????????3μg

DEPC水???????????補(bǔ)足至14μl

2）70℃加熱5?min后迅速在冰上冷卻2?min，5000rpm離心10s后加入以下各組分：

RNasin??????????????1?μl

5×First-Strand?Buffer??4?μl

TIANScript?M-MLV???1?μl

3）混勻，5000rpm離心10s；

4）42℃溫浴50?min；

5）95℃加熱5min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存；

3．半定量RT-PCR技術(shù)檢測普通野生稻磷酸肌醇3-激酶EST片段的差異表達(dá)情況

1）RT-PCR反應(yīng)體系：

總體積25?μl?

10×PCR?buffer???????????2.5μl

MgCl₂???????????????????2?μl?

dNTP(2.5?mM?each)???????2?μl

上游引物（10?μM）???????1?μl

下游引物（10?μM）???????1?μl

Taq?DNA?polymerase(5?U/μl)?0.5?μl

cDNA???????????????????1?μl

ddH2O??????????????????15?μl

以堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示的上游引物和堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示的下游引物作為RT-PCR反應(yīng)引物，分別以步驟2獲得的cDNA作為RT-PCR反應(yīng)模板；

2）PCR反應(yīng)程序：

94℃預(yù)變性5?min，94℃變性35s，43℃退火30s，72℃延伸1?min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10?min；

3）PCR結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，每個(gè)點(diǎn)樣孔中上樣10?μl?PCR產(chǎn)物，檢測該磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻葉片未接種白葉枯病菌的對(duì)照和接種白葉枯病菌處理后24?h、48?h、72?h、96?h、120?h?5個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)情況；當(dāng)在未接種白葉枯病菌的葉片中檢測不到該磷酸肌醇3-激酶EST片段的表達(dá)，只在接種了白葉枯病菌的普通野生稻葉片中能檢測到它的表達(dá)，則該磷酸肌醇3-激酶EST片段屬于白葉枯病菌脅迫的誘導(dǎo)型表達(dá)基因，當(dāng)在未接種白葉枯病菌和接種白葉枯病菌的普通野生稻葉片的5個(gè)時(shí)期均表達(dá)，則該磷酸肌醇3-激酶EST片段為組成型表達(dá)基因。