[發(fā)明專利]一種重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210129184.2
• 申請日: 2012-04-28
• 公開（公告）號: CN102643887A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 時(shí)成波;曹玉鋒;徐軍
• 申請（專利權(quán)）人: 長春生物制品研究所有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市君勝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 44268
• 代理人: 王永文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法。

背景技術(shù)

戊型肝炎在亞洲、非洲及中美洲等發(fā)展中國家是一種非常嚴(yán)重的傳染病，是導(dǎo)致發(fā)病及病死的重要因素。在一些發(fā)展中國家戊型肝炎可占到急性病毒性肝炎的50％，孕婦死亡率高達(dá)20％。1986～1988年在我國新疆的爆發(fā)流行，造成二十萬人發(fā)病，孕婦平均死亡率為13．46％。因此，加強(qiáng)對戊型肝炎的預(yù)防控制極為必要。戊型肝炎病毒（HEV）是一種經(jīng)腸道傳播的病原體，是一種無包膜的單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，直徑27～34nm，表面粗糙，不規(guī)則，在胞漿中裝配，呈晶格狀排列，可形成包涵體。HEV基因組全長約7.5kb，有3個(gè)開放性讀碼框(ORF)，分別為ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2基因長約2kb，為主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)，編碼病毒衣殼蛋白(pORF2)，產(chǎn)物為分子量約76kDa的糖基化蛋白，其c末端約200個(gè)氨基酸范圍內(nèi)有多個(gè)重要的免疫抗原表位。目前較為普遍的分型標(biāo)準(zhǔn)將HEV分為四個(gè)主要基因型，即基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，其代表株分別為緬甸株、墨西哥株、美國株及中國株，各基因型在全球的地理分布有明顯的差異。自2000年以來，Ⅳ型HEV已經(jīng)成為在中國流行的主要基因型。

由于HEV不能在體外培養(yǎng)，目前無法制備HEV滅活病毒疫苗和減毒活疫苗，國內(nèi)外研究多為基因重組疫苗，候選抗原肽多集中于ORF2區(qū)。有學(xué)者利用桿狀病毒—昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或漢遜酵母系統(tǒng)等真核系統(tǒng)成功表達(dá)了HEV重組蛋白，但真核表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低、工藝復(fù)雜、成本高等問題。廈門大學(xué)等多家研發(fā)單位采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，需要變性、復(fù)性等步驟，收率低、工藝復(fù)雜。

因此，現(xiàn)有戊型肝炎疫苗制備工藝有待于完善和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)率高，工藝簡單，制備成本低的重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法，包括以下步驟：

A，培養(yǎng)工程菌株，并制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基；

B，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌處理后，接入所述工程菌株；

C，監(jiān)測所述工程菌株的細(xì)菌細(xì)胞密度OD600，當(dāng)所述OD600的值為40～80時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)；

D，當(dāng)所述OD600的值至少提高百分之五時(shí)，進(jìn)行收菌；

E，離心提純后，即得P179蛋白；

在所述步驟B~D過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，當(dāng)葡萄糖的含量少于預(yù)定值時(shí)，增加補(bǔ)料培養(yǎng)基，使得葡萄糖的含量等于或大于所述預(yù)定值。

所述的重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法，其中，步驟A中的所述工程菌株為大腸桿菌HEV179/BL21(DE3)。

所述的重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法，其中，步驟A中的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30~50g，酵母粉90~100g，蛋白胨200~250g，NaCl?80~100g，MgSO₄?8~15g，消泡劑2~5ml，KH₂PO₄?35~45g，Na₂HPO₄·12H₂O?120~150g，加蒸餾水定容至20L。

所述的重組戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的發(fā)酵制備方法，其中，步驟A中的所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方還包括微量元素?30~50?ml，所述微量元素的配方為：FeSO₄·7H₂O?0.1~0.2g，CaC1₂·2H₂O?0.025~0.05g，ZnSO₄·7H₂O?0.0225~0.05g，MnSO₄·H₂O?0.001~0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O?0.001~0.005g，Na₂B₄O₇·12H₂O?0.0002~0.0005g，CuS0₄·5H₂O?0.01~0.04g，CoCl₂·6H₂O?0.001~0.005g，加蒸餾水定容至1L。